A. DNA模板：
· 盡量使用高質(zhì)量,、純化后的DNA作為模板
· 需要提高保真度時，可使用較高的DNA模板濃度并減少循環(huán)數(shù)
· 模板用量：以50 μl反應(yīng)體系為例——
人基因組DNA：0.1~1.0 μg
大腸桿菌基因組DNA：10~100 ng
Lambda DNA：0.5~5 ng
質(zhì)?；虿《綝NA：0.1~10 ng
B. 引物設(shè)計原則：
· 引物長度要滿足特異性需要,，一般可在18~25個堿基之間；擴(kuò)增長片段時最好在24~30個堿基之間,；
· 當(dāng)引入克隆位點時,，引物末端應(yīng)額外增加3個以上堿基；
· (G+C)%含量應(yīng)盡量控制在40~60%,，兩條引物的(G+C)%含量應(yīng)盡量接近,；
· 引物中GC堿基分布均勻；
· 盡量避免相同堿基連續(xù)出現(xiàn)三次以上,，3’端應(yīng)避免使用A或T,；
· 避免引物內(nèi)部自身配對形成二級結(jié)構(gòu)；
· 正反向引物之間應(yīng)避免配對堿基,，尤其是3’端的三個堿基,，否則易生成引物二聚體(Primer dimer)；
· 兩條引物的解鏈溫度（Tm）值應(yīng)在42~65℃之間，而且兩條引物間最好相差不超過5℃,；
· 引物Tm值的計算方法：
20 nt以下：Tm = 2℃ x (A + T) + 4℃ x (G + C)
20 nt以上：Tm = 81.5 + 0.41 x (GC%) -600/nt (nt：引物的堿基數(shù))
· 引物用量：
· 0.1~1.0 μM,，通常可以0.2 μM起始,，根據(jù)體系不同調(diào)整用量,；
· 使用簡并引物、隨機(jī)引物時,，需增加引物總量以彌補產(chǎn)量損失,；但隨著引物量加大，特異性將降低,；
· 模板較大較多,，或結(jié)構(gòu)較復(fù)雜(如人基因組DNA)時，需減少引物用量以提高特異性,；
· 模板較小較少(如質(zhì)粒模板)時,，增加引物用量可提高產(chǎn)量。
C. 核苷酸（dNTPs）：
· 常規(guī)dNTPs濃度為每種核苷酸0.1~1.0 mM,，通?？梢?.2 mM起始，根據(jù)體系不同調(diào)整用量,；
· 低濃度（0.05~0.1 mM）可增加保真性,，但會降低產(chǎn)量；
· 高濃度提高產(chǎn)量,，尤其是長片段PCR，但會降低保真度,。
D. 鎂離子濃度
· 對于Taq DNA聚合酶,，鎂離子的最佳濃度為1.5~2.0 mM；
· 最佳濃度取決于模板,、緩沖液,、DNA和dNTPs（每一種都有可能鰲合鎂離子）；
· 鎂離子濃度過低,，會降低產(chǎn)量,；
· 鎂離子濃度過高，會增加非特異性PCR產(chǎn)物,；
· 優(yōu)化鎂離子濃度時,，通常以0.5 mM梯度遞增，最高到4 mM,。
E. Taq DNA 聚合酶濃度
· 推薦使用濃度為 1~2.5 U/50 μl反應(yīng)體系,。
F. 起始反應(yīng)
· 在冰上配制反應(yīng)體系；
· 最后加聚合酶；
· 將熱循環(huán)儀預(yù)熱至變性溫度(94℃)后,，放入PCR管,，立即進(jìn)行反應(yīng)。
G. 變性溫度與時間
· 通常于94℃初始變性,，使DNA雙鏈全打開,；
· 變性時間通常為15~30秒；
· 避免長時間或高溫度孵育,；
· 高GC含量模板可提高變性溫度至98℃,。
H. 退火溫度與時間
· 通常情況下，退火溫度為引物Tm值減5℃,，在55~60℃之間,；
· 提高退火溫度有利于減少非特異性條帶；
· 常規(guī)退火時間為15~30秒,。
I. 延伸溫度與時間
· 延伸反應(yīng)通常在72℃下進(jìn)行,。
· Taq酶的延伸時間大約為15~30秒/kb DNA；
· 產(chǎn)物小于1 kb時,，建議延伸時間為30~60秒,；
· 產(chǎn)物大于3 kb或反應(yīng)超過30個循環(huán)時，可能需要更長的延伸時間,。
典型的循環(huán)條件：
預(yù)變形94℃ 2 分鐘
94℃ 30秒,，
55℃ 30秒，
72℃ 1分鐘/1 kb,，25~30個循環(huán)
72℃ 5分鐘
注：上述反應(yīng)條件適用于普通Taq DNA聚合酶催化的PCR反應(yīng),。當(dāng)DNA模板富含GC、具有復(fù)雜二級結(jié)構(gòu),、低濃度或產(chǎn)物>5 kb時可能需要改變相應(yīng)條件
