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當(dāng)前位置：迪圖（上海）生物科技有限公司>>技術(shù)文章>>PCR反應(yīng)有那些要素流程
引物：引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度,。理論上,，只要知道任何一段模板DNA序列， 就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈做引物,，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴(kuò)增,。
設(shè)計(jì)引物應(yīng)遵循以下原則：
①引物長度：15-30bp，常用為20bp左右,。
②引物擴(kuò)增跨度：以200-500bp為宜,，特定條件下可擴(kuò)增長至10kb的片段。
③引物堿基：G+C含量以40-60%為宜,，G+C太少擴(kuò)增效果不佳,，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC最好隨機(jī)分布,，避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列,。
④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補(bǔ),，特別是3'端的互補(bǔ),，否則會(huì)形成引物二聚體,，產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶。
⑤引物3'端的堿基,，特別是最末及倒數(shù)第二個(gè)堿基,，應(yīng)嚴(yán)格要求配對，以避免因末端堿基不配對而導(dǎo)致PCR失敗,。
⑥引物中有或能加上合適的酶切位點(diǎn),， 被擴(kuò)增的靶序列最好有適宜的酶切位點(diǎn)， 這對酶切分析或分子克隆很有好處,。
⑦引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性,。引物量：每條引物的濃度0.1～1umol或10～100pmol，以低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好,，引物濃度偏高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增,，且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會(huì)。
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