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聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)
一、發(fā)展簡史
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)是一種用于放大擴增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù),,它可看作是生物體外的特殊DNA復(fù)制,,PCR的特點,是能將微量的DNA大幅增加,。因此,,無論是化石中的古生物、歷史人物的殘骸,,還是幾十年前兇殺案中兇手所的毛發(fā),、皮膚或血液,只要能分離出一丁點的DNA,,就能用PCR加以放大,,進行比對。這也是"微量證據(jù)"的威力之所在,。
1983年美國Mullis首先提出設(shè)想,,1985年由其發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng),即簡易DNA擴增法,,意味著PCR技術(shù)的真正誕生,。
二,、實驗原理
類似于DNA的體內(nèi)復(fù)制,。
首先待擴增DNA模板加熱變性解鏈,隨之將反應(yīng)混合物冷卻至某一溫度,,這一溫度可使引物與它的靶序列發(fā)生退火,,再將溫度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。這種熱變性-復(fù)性-延伸的過程就是一個PCR循環(huán),。
PCR過程是由變性,,退火,延伸3個步驟組成的不斷重復(fù)的過程,。標(biāo)準(zhǔn)的PCR過程分為三步:
1.DNA變性(90℃-96℃):雙鏈DNA模板在熱作用下,,氫鍵斷裂,形成單鏈DN
2.退火(復(fù)性)(40℃-65℃):系統(tǒng)溫度降低,,引物與DNA模板結(jié)合,,形成局部雙鏈。
3.3.延伸(68℃-75℃):在Taq酶(在72℃左右的活性)的作用下,以dNTP為原料,,從引物的5′端→3′ 端延伸,,合成與模板互補的DNA鏈。
每一循環(huán)經(jīng)過變性,、退火和延伸,,DNA含量既增加一倍。
三,、PCR反應(yīng)要素:
PCR擴增儀、PCR反應(yīng)管,、PCR離心管,、移液器、凝膠電泳設(shè)備,、冰盒,、離心機
模板、PCR引物,、TaqDNA聚合酶,、dNTP反應(yīng)緩沖液、Mg2+,、ddH2O,。
模板:DNA102~105拷貝
引物
底物:4種dNTP
TaqDNA聚合酶
緩沖液
體積:
模板:RNA
引物:oligo(dT)12~18
底物:4種dNTP
逆轉(zhuǎn)錄酶
緩沖液
其他試劑:RNA酶抑制劑,MgCl2.DTT.
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