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進口PCR實驗原理及反應(yīng)要素介紹
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)
一,、發(fā)展簡史
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction,PCR）是一種用于放大擴增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù),，它可看作是生物體外的特殊DNA復(fù)制,，PCR的特點,，是能將微量的DNA大幅增加,。因此，無論是化石中的古生物,、歷史人物的殘骸,，還是幾十年前兇殺案中兇手所的毛發(fā)、皮膚或血液,，只要能分離出一丁點的DNA,，就能用PCR加以放大，進行比對,。這也是"微量證據(jù)"的威力之所在,。
1983年美國Mullis首先提出設(shè)想，1985年由其發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng),，即簡易DNA擴增法,，意味著PCR技術(shù)的真正誕生。
二,、實驗原理
類似于DNA的體內(nèi)復(fù)制,。
首先待擴增DNA模板加熱變性解鏈，隨之將反應(yīng)混合物冷卻至某一溫度,，這一溫度可使引物與它的靶序列發(fā)生退火,，再將溫度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸,。這種熱變性-復(fù)性-延伸的過程就是一個PCR循環(huán)。
PCR過程是由變性,，退火,，延伸3個步驟組成的不斷重復(fù)的過程。標(biāo)準(zhǔn)的PCR過程分為三步：
1.DNA變性（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下,，氫鍵斷裂,，形成單鏈DN
2.退火（復(fù)性）（40℃-65℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合,，形成局部雙鏈,。
3.3.延伸（68℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右的活性）的作用下，以dNTP為原料,，從引物的5′端→3′ 端延伸,，合成與模板互補的DNA鏈。
每一循環(huán)經(jīng)過變性,、退火和延伸,，DNA含量既增加一倍。
三,、PCR反應(yīng)要素：
- DNA模版：可以是雙鏈,、單鏈、提取染色體的DNA,、克隆的質(zhì)粒DNA,，
- 引物：一對寡聚DNA，分別與模板兩側(cè)的3’端序列互補,，可使DNA序列得到擴增
- DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶）：催化DNA合成,，
- 緩沖液：提供DNA合成反應(yīng)所需的PH,離子強度等環(huán)境
- 4種單核苷酸：dNTP,提供DNA合成原料
- 實驗材料
PCR擴增儀、PCR反應(yīng)管,、PCR離心管,、移液器、凝膠電泳設(shè)備,、冰盒,、離心機
模板、PCR引物,、TaqDNA聚合酶,、dNTP反應(yīng)緩沖液、Mg2+,、ddH2O,。
- PCR反應(yīng)體系
- 以DNA為模板的反應(yīng)體系：
模板：DNA102~105拷貝
引物
底物：4種dNTP
TaqDNA聚合酶
緩沖液
體積：
- 以mRNA為模板的反應(yīng)（逆轉(zhuǎn)錄PCR）
模板：RNA
引物：oligo(dT)12~18
底物：4種dNTP
逆轉(zhuǎn)錄酶
緩沖液
其他試劑：RNA酶抑制劑，MgCl2.DTT.