人空泡毒素相關(guān)蛋白A（VacA）酶聯(lián)免疫試劑盒原理用于體外定量檢測血清、血漿,、組織,、細胞上清及相關(guān)液體樣本中人空泡毒素相關(guān)蛋白A（VacA）的含量。

人空泡毒素相關(guān)蛋白A（VacA）酶聯(lián)免疫試劑盒原理

l 本試劑盒用于體外定量檢測血清,、血漿,、組織、細胞上清及相關(guān)液體樣本中人空泡毒素相關(guān)蛋白A（VacA）的含量,。

l 有效期：6個月

l 保存條件：2-8℃

l 本試劑盒僅供體外研究使用,，不用于臨床診斷

 實驗原理

試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）。往預(yù)先包被人空泡毒素相關(guān)蛋白A（VacA）捕獲抗體的包被微孔中,，依次加入標(biāo)本,、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP標(biāo)記的檢測抗體,，經(jīng)過溫育并*洗滌,。用底物TMB顯色,，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色,。顏色的深淺和樣品中的人空泡毒素相關(guān)蛋白A（VacA）呈正相關(guān),。用酶標(biāo)儀在450nm 波長下測定吸光度（OD 值），計算樣品濃度,。

人空泡毒素相關(guān)蛋白A（VacA）酶聯(lián)免疫試劑盒原理安全性

1）避免直接接觸終止液和底物A,、B。一旦接觸到這些液體,，請盡快用水沖洗,。

2）實驗中不要吃喝、抽煙或使用化妝品,。

3）不要用嘴吸取試劑盒里的任何成份,。

操作注意事項

1）試劑應(yīng)按標(biāo)簽說明書儲存，使用前恢復(fù)到室溫,。稀稀過后的標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)丟棄,，不可保存。

2）實驗中不用的板條應(yīng)立即放回包裝袋中,，密封保存,，以免變質(zhì)。

3）不用的其它試劑應(yīng)包裝好或蓋好,。不同批號的試劑不要混用,。保質(zhì)前使用,。

4）使用一次性的吸頭以免交叉污染,，吸取終止液和底物A、B液時,，避免使用帶金屬部分的加   樣器,。

5）使用干凈的塑料容器配置洗滌液。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品,。

6）洗滌酶標(biāo)板時應(yīng)充分拍干,，不要將吸水紙直接放入酶標(biāo)反應(yīng)孔中吸水。

7）底物A應(yīng)揮發(fā),，避免長時間打開蓋子,。底物B對光敏感，避免長時間暴露于光下,。避免用手   接觸,，有毒。實驗完成后應(yīng)立即讀取OD值,。

8）加入試劑的順序應(yīng)*,，以保證所有反應(yīng)板孔溫育的時間一樣,。

9）按照說明書中標(biāo)明的時間、加液的量及順序進行溫育操作,。

樣品收集,、處理及保存方法

1）血清-----操作過程中避免任何細胞刺激。使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管,。收集血液后,，1000×g離心10分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。

2）血漿-----EDTA,、檸檬酸鹽,、肝素血漿可用于檢測。1000×g離心30分鐘去除顆粒,。

3）細胞上清液---1000×g離心10分鐘去除顆粒和聚合物,。

4）組織勻漿-----將組織加入適量shengli鹽水搗碎。1000×g離心10分鐘,，取上清液

5）保存------如果樣品不立即使用,，應(yīng)將其分成小部分-70 ℃保存，避免反復(fù)冷凍,。盡可能的不要使用溶血或高血脂血,。如果血清中大量顆粒，檢測前先離心或過濾,。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍,。應(yīng)在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

試劑的準(zhǔn)備

1）標(biāo)準(zhǔn)品：標(biāo)準(zhǔn)品的系列稀釋應(yīng)在實驗時準(zhǔn)備,，不能儲存,。稀釋前將標(biāo)準(zhǔn)品振蕩混勻。

2）洗滌緩沖液（50×）的稀釋：蒸餾水50倍稀釋,。

操作步驟

1）使用前,，將所有試劑充分混勻。不要使液體產(chǎn)生大量的泡沫,，以免加樣時加入大量的氣泡,，產(chǎn)生加樣上的誤差。

2）根據(jù)待測樣品數(shù)量加上標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)量決定所需的板條數(shù),。每個標(biāo)準(zhǔn)品和空白孔建議做復(fù)孔,。 每個樣品根據(jù)自己的數(shù)量來定，能使用復(fù)孔的盡量做復(fù)孔,。標(biāo)本用標(biāo)本稀釋液1：1稀釋后加入50ul于反應(yīng)孔內(nèi),。

3）加入稀釋好后的標(biāo)準(zhǔn)品50ul于反應(yīng)孔、加入待測樣品50ul于反應(yīng)孔內(nèi)。立即加入50ul的生物 素標(biāo)記的抗體,。蓋上膜板,，輕輕振蕩混勻，37℃溫育1小時,。

4）甩去孔內(nèi)液體,，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒,，甩去洗滌液,，用吸水紙拍干。重復(fù)此操作3   次,。如果用洗板機洗滌,，洗滌次數(shù)增加一次。

5）每孔加入80ul的親和鏈酶素-HRP,，輕輕振蕩混勻,，37℃溫育30分鐘。

6）甩去孔內(nèi)液體,，每孔加滿洗滌液,，振蕩30秒，甩去洗滌液,，用吸水紙拍干,。重復(fù)此操作3次。如果用洗板機洗滌,，洗滌次數(shù)增加一次,。

7）每孔加入底物A、B各50ul,，輕輕振蕩混勻,，37℃溫育10分鐘。避免光照,。

8）取出酶標(biāo)板,，迅速加入50ul終止液,，加入終止液后應(yīng)立即測定結(jié)果,。

9）在450nm波長處測定各孔的OD值。

結(jié)果判斷與分析

1,、儀器值：于波長450nm的酶標(biāo)儀上讀取各孔的OD值

2,、以吸光度OD值為縱坐標(biāo)（Y），相應(yīng)的待測物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)（X）,，做得相應(yīng)的曲線,，樣品的待測物質(zhì)含量可根據(jù)其OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出相應(yīng)的濃度。