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熒光定量服務


熒光定量PCR的基本原理就是在PCR擴增過程中,，隨著PCR循環(huán)數(shù)的遞增，PCR產(chǎn)物不斷積累,，熒光信號也會相應的增加,，這樣就可以通過熒光強度的變化來對PCR反應進行實時的監(jiān)測，并以b-Actin或GAPDH等管架基因作為內(nèi)參照,，對目的基因的表達量進行半定量檢測,。

科佰生物將根據(jù)您的科研需求可以提供SYBR Green染料法和TaqMan探針法,。通過對DNA或RNA的熒光定量PCR監(jiān)測, 實現(xiàn)基因的相對定量、定量和定性分析,。

SYBR Green熒光染料法：適用于任何DNA,，無需設計探針，采取雙標準曲線法,，實驗周期短,，結(jié)果重復性好，靈敏度高,。

TaqMan熒光探針法：經(jīng)驗豐富的實驗技術人員設計探針,，對目標基因有高特異性，實驗重復性好,，相對于SYBR Green法,，靈敏度更高。

1.定量：

定量首先必須構(gòu)建與檢測樣品目的基因具有相同序列的標準品,。使用已知濃度的標準品制作3個點以上的標準曲線后，可以使用標準曲線對未知濃度的檢測樣品進行量（起始拷貝數(shù)）分析,。

2.相對定量（mRNA表達量分析）：

基因表達的研究一般采用相對定量的方法,。相對定量法必須對樣品的目的基因和參比基因內(nèi)標同時分別進行定量，然后求出對于參比基因的目的基因的相對量,。通過對樣品間的目的基因的相對量進行比較,，可以對不同樣品間的mRNA進行表達量分析。參比基因通常選用表達量相對恒定的House Keeping Gene,，如：GAPDH,、b-actin等,。通過同時對參比基因的實時檢測,，可以對樣品之間由于起始細胞數(shù)不同、或RNA提取效率的不同等造成的RNA量誤差進行校正,，達到在嚴格意義上對樣品之間的mRNA表達量進行分析之目的,。

1、總 RNA 提取及定量,；

2,、PCR 引物設計及反轉(zhuǎn)錄；

3,、熒光引物設計（SYBR Green 熒光染料法）/探針設計（TaqMan 熒光探針法),；

4、熒光定量PCR,，進行擴增曲線,、溶解曲線,、表達量差異分析等實驗；

5,、數(shù)據(jù)分析與處理,；

6、完整實驗報告,。

樣品要求：

1.樣品可提供組織,、細胞、RNA,、cDNA中的一種,對于提供樣本的大致原則如下：組織樣本,盡可能提供2×2×2mm3體積或以上,新鮮組織可直接提供,，不需處理；對于細胞樣本,，盡可能提供3×10^6個細胞左右,加適量Trizol處理即可,，確保樣品適于RNA抽提。RNA,、cDNA含量根據(jù)同等細胞數(shù)量的細胞抽提和逆轉(zhuǎn)錄大致界定, 如果提供RNA或cDNA我們要對您提供的材料進行評估,。

2.客戶提供盡可能詳細的背景信息；物種信息,，擴增目的基因的NCBI登錄號等,。

3.運輸要求，液氮或干冰保存寄送,。

注：樣本應避免各類污染和反復凍融,。

提交的產(chǎn)品和資料：

1.RNA濃度及熒光定量PCR原始數(shù)據(jù)及分析結(jié)果；

2.熒光定量PCR完整的實驗步驟,、使用儀器,、軟件設置參數(shù)等。