首頁 >> 公司動(dòng)態(tài) >> 串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測定人體尿液中4種有機(jī)磷農(nóng)藥代謝物
1 引 言
繼有機(jī)氯農(nóng)藥被禁用后,，有機(jī)磷類農(nóng)藥（Organophosphorus pesticides,，OPs）成為國內(nèi)目前農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上應(yīng)用廣泛、使用量大的農(nóng)藥[1],。OPs具有易降解,、殺蟲效果好、抗性不顯著,、殘效期較短的特點(diǎn),，除廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中[2]，還常作為除草劑應(yīng)用于公園,、綠地等公共場所,。
OPs進(jìn)入人體后代謝迅速，蓄積現(xiàn)象不明顯,。OPs由于其結(jié)構(gòu)的相似性,，進(jìn)入體內(nèi)后一般都能代謝成為6種二烷基磷酸酯（DialkylPhosphates，DAP）代謝產(chǎn)物中的1種或幾種,，在較短的時(shí)間內(nèi)隨尿排出[3],，主要有機(jī)磷農(nóng)藥代謝產(chǎn)物見表1。除6種二烷基磷酸酯外,，OPs還會(huì)產(chǎn)生特殊代謝產(chǎn)物,，每種特殊代謝產(chǎn)物通常只由特定的1種或幾種OPs代謝產(chǎn)生，如毒死蜱,、甲基毒死蜱的特殊代謝產(chǎn)物為3,，5，6三氯2吡啶醇（3,，5,，6TCP），對硫磷,、甲基對硫磷的特殊代謝產(chǎn)物為對硝基酚,，馬拉硫磷的特殊代謝產(chǎn)物為馬拉硫磷二羥基酸[4]。
近年來,，農(nóng)藥暴露對人體健康的影響受到廣泛關(guān)注[6～9],。根據(jù)OPs代謝較快的特點(diǎn)，檢測人群尿液樣品中OPs非特異性及特異性代謝物含量可有效評估人體的OPs暴露水平,。檢測尿液中OPs代謝物的方法主要有氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法[10～12],、氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[13～15]、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[16～18],。液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法前處理較為簡單,，但實(shí)際應(yīng)用中靈敏度不高，且基質(zhì)效應(yīng)造成的離子抑制比較普遍[19],。提取尿液中DAPs的方法主要有液/液萃取[10～12,，15～17],、固相萃取[13，20],、凍干法[14],。本研究采用固相萃取液/液萃取氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)建立了人體尿液中3種OPs非特異性代謝產(chǎn)物及1種特殊代謝產(chǎn)物的高靈敏檢測方法，避免了液/液萃取使用yi醚對實(shí)驗(yàn)室造成的安全隱患,，實(shí)驗(yàn)時(shí)間大幅縮短，凈化效率優(yōu)于凍干法,。本方法為有機(jī)磷農(nóng)藥的人體內(nèi)暴露研究提供了良好的技術(shù)支撐,。
2 實(shí)驗(yàn)部分
2.1 儀器與試劑
Quattra micro GCMS/MS（美國Waters公司）；AG285電子天平（瑞士Mettler公司）,； MG2200氮吹儀（日本EYELA公司）,；R210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（瑞士Buchi公司）；WH3微型旋渦混合儀（上海楚定分析儀器有限公司,，中國）,；Centrifuge C5804離心機(jī)、恒溫混勻儀（德國 Eppendorf公司）,；MilliQ純水器（美國Mimpore公司）,。
乙腈、乙酸乙酯,、甲苯（分析純,，南京化學(xué)試劑有限公司）；甲醇,、甲酸（色譜純,，德國Merck公司）；N叔丁基二甲基甲硅烷基N甲基三氟乙酰胺（MTBSTFA,，>97.0%,，美國Aldrich公司）。 其它試劑均為國產(chǎn)分析純,。
Waters Oasis WCX固相萃取柱（150 mg,，6 mL）、Waters Oasis HLB固相萃取柱（200 mg,，6 mL）,、Waters Oasis WAX固相萃取柱（60 mg，3 mL）,，均購自美國Waters公司,。
固相萃取DAPs：吸取尿液10.0 mL于100 mL具塞塑料離心管中，加入100 μL濃HCl,，渦旋1 min,，上樣于Waters Oasis WCX固相萃取柱（柱子提前用6 mL甲醇,、6 mL水活化），通過固相萃取小柱的尿液樣品收集于100 mL塑料離心管中,。上樣后,，干燥，用8 mL 10%甲酸甲醇溶液洗脫,，洗脫液置于10 mL具塞比色管中,。
液/液萃取TCP：通過固相萃取小柱的尿液樣品中加入適量NaOH，使樣品pH≈7.0,，加入2 g NaCl,，渦旋至溶解，加入20 mL乙酸乙酯乙腈（70∶30,， V/V）,，渦旋3 min，6000 r/min離心5 min,。上清液經(jīng)過含適量無水Na2SO4的漏斗轉(zhuǎn)移至雞心瓶中,，旋蒸濃縮至2 mL左右。
用移液器將萃取濃縮液移出至含洗脫液的比色管中,，40℃水浴中氮吹至*干燥,，比色管中加入0.5 mL甲苯，渦旋1 min,，轉(zhuǎn)移至1.5 mL玻璃小管中,，加入10 μL 0.2 mg/L內(nèi)標(biāo)DBP，20 μL MTBSTFA,，置于90℃恒溫混勻儀中衍生化30 min,。
衍生化后的溶液冷卻至室溫，過0.22 μm有機(jī)相濾膜,，供GCMS/MS分析,。
2.3 氣相色譜條件
DB5MS色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；程序升溫：60℃保持2 min,，以5℃/min升至90℃,，以12℃/min升至160℃，再以10℃/min升至280℃,，保持2 min,；進(jìn)樣量1.0 μL；不分流進(jìn)樣,，載氣：氦氣（99.999%）,，流量：1.0 mL/min，進(jìn)樣器溫度： 250℃。
2.4 質(zhì)譜條件正離子模式的電噴霧電離ESI+,，多反應(yīng)離子監(jiān)測（MRM）,，TCP采用選擇離子檢測（SIM）， EI源轟擊能：70 eV,，離子源溫度：180℃,，傳輸線溫度：250℃，溶劑延遲時(shí)間：5.0 min,，碰撞氣：高純氬氣,，保留時(shí)間定性，內(nèi)標(biāo)法定量,。其它質(zhì)譜參數(shù)見表2,。
3 結(jié)果與討論
3.1 基質(zhì)的選擇
選擇基質(zhì)時(shí)，如采用人工合成尿液進(jìn)行實(shí)驗(yàn),，雖然本底較為干凈，干擾小,，但人工尿液中不含蛋白質(zhì),，與實(shí)際尿液有很大差距，不能有效反映人體實(shí)際尿液基質(zhì)的復(fù)雜性,。如采用單個(gè)個(gè)體尿液作為基質(zhì),，有的個(gè)體存在較高的本底值，不適合測定方法的建立,。因此,，本實(shí)驗(yàn)通過篩選不同個(gè)體的尿液，選擇本底干擾較小的人體尿液作為本實(shí)驗(yàn)的基質(zhì),。
3.2 前處理?xiàng)l件優(yōu)化
3.2.1 液/液萃取 文獻(xiàn)報(bào)道DAPs和TCP提取均采用液/液萃取的方法,，故本實(shí)驗(yàn)首先采用液/液萃取的方法提取DAPs和TCP。萃取溶劑見表3,，結(jié)果見圖2,。結(jié)果表明，采取液/液萃取法提取DAPs時(shí),，同一提取方案對不同代謝物提取回收率差別較大,，很難找到平衡方案使各代謝物的回收率均符合要求，TCP的液/液萃取回收率較高,。由于TCP的pKa=7.5,，近中性，故萃取時(shí)將溶液調(diào)至pH ≈7,，確保萃取時(shí)TCP的存在形式為分子態(tài)[18],。
3.2.2 固相萃取柱的選擇
目前文獻(xiàn)所報(bào)道的DAPs和TCP提取多采用液/液萃取法，固相萃取法的報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)分別考察了親水親油平衡柱（Waters Oasis HLB）,、弱陽離子交換柱（Waters Oasis WCX）及弱陰離子交換柱（Waters Oasis WAX）對各代謝物的萃取效果,，結(jié)果見圖3。
Waters Oasis HLB柱雖然適用范圍較廣,，可從各種基質(zhì)中分離出多種酸性,、堿性和中性化合物，但DMTP回收率過高,，其它物質(zhì)則過低,。Waters Oasis WAX柱為弱陰離子交換柱，適用于酸性物質(zhì),， 具有高選擇性,，DAPs為酸性（DMP pKa=1.25， DMTP pKa=1.37,， DEP pKa=1.37,， DETP pKa=1.49），但本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其對DMP,、DEP基本沒有保留,，對DMTP、DETP雖有保留,，但回收率非常不穩(wěn)定,，不適用于從尿液中提取DAPs，而TCP的pKa近中性,，不易被WAX柱吸附,。
Waters Oasis WCX柱對DMTP、DEP,、DETP,、TCP均有保留，且回收率較穩(wěn)定,。Waters Oasis WCX柱為陽離子交換柱,，可吸附帶正電的分子。DAPs的pKa較低,，呈酸性,，實(shí)驗(yàn)中采用強(qiáng)酸酸化并不會(huì)使DAPs分子解離，而分子中的硫原子及氧原子含有孤對電子,，吸引溶液中的氫質(zhì)子,，從而使DAPs分子質(zhì)子化，帶正電荷,，可被WCX柱吸附,。DMP相比于其它的DAPs,，由于極性較大，正電性較弱,，在WCX柱上基本無保留,。WCX柱對除DMP外的DAPs及TCP均有保留，故選其作為固相萃取柱,，并對其洗脫條件進(jìn)行優(yōu)化,。
3.2.3 洗脫條件的優(yōu)化 在洗脫條件的優(yōu)化中，分別考察10%甲酸甲醇溶液,、20%甲酸甲醇溶液,、30%甲酸甲醇溶液，10%甲酸乙腈溶液的洗脫效果,，結(jié)果見圖4,。使用10%甲酸甲醇作為洗脫液時(shí)，各代謝物回收率在34.9%～77.5%之間（DMP基本無回收）,，高于20%甲酸甲醇溶液得到的回收率,，且較30%甲酸甲醇溶液得到的回收率更為穩(wěn)定。10%甲酸乙腈溶液的洗脫效果與10%甲酸甲醇溶甲醇溶液相當(dāng),，TCP基本無回收,。隨著酸度增加，DAPs的回收率基本都是呈先降低再升高的趨勢,。使用10%甲酸甲醇作為洗脫液，回收率可以接受,，且較為穩(wěn)定,。
3.3 固相萃取與液/液萃取的比較
采用表3中方案4作為液/液萃取方法，與優(yōu)化過的固相萃取方法進(jìn)行回收率的比較,，結(jié)果見圖5,。
對于DMTP， DEP和DETP,，固相萃取的回收率和穩(wěn)定性均高于液/液萃取,。對于生物基質(zhì)樣品分析，方法的穩(wěn)定性十分重要,。液/液萃取提取TCP的回收率和穩(wěn)定性優(yōu)于固相萃取,。用何種提取方法DMP，結(jié)果均不能令人滿意,。終采用固相萃取提取DMTP,， DEP和DETP，采用表3中方案4提取TCP,。
3.4 衍生化反應(yīng)
本實(shí)驗(yàn)采用硅烷化試劑N（叔丁基二甲基硅烷基）N甲基三氟乙酰胺（MTBSTFA）對目標(biāo)化合物進(jìn)行衍生化反應(yīng),。目標(biāo)代謝物與衍生化試劑MTBSTFA的反應(yīng)原理如圖6所示，通過硅烷化作用將叔丁基二甲基硅烷基引入目標(biāo)代謝物分子中，取代分子中的活性氫,。
文獻(xiàn)[5,，10，11,，20,，21]采用五氟溴芐苯（PFBBr）對DAPs進(jìn)行衍生化，衍生化反應(yīng)需加入適量K2CO3,。與采用PFBBr相比,，MTBSTFA的衍生化反應(yīng)時(shí)間較短（PFBBr衍生化反應(yīng)需16 h[21]），不需要其它試劑參與,，不必考慮其它試劑的用量對衍生化效率的影響,。
3.5 方法學(xué)驗(yàn)證
3.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍 向尿樣中添加目標(biāo)代謝物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按2.2節(jié)中前處理方法進(jìn)行提取,、凈化,，在優(yōu)化后的色譜及質(zhì)譜條件下進(jìn)樣，繪制工作曲線,，記錄各待測物色譜峰面積（As）與內(nèi)標(biāo)色譜峰面積（Ar）,。以各待測物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比R （R= As/As）對濃度（C，mg/L）進(jìn)行線性回歸,，確定線性范圍及檢出限,、定量限。檢出限和定量限分別以3和10倍信噪比的濃度來確定,。DMP在固相萃取柱上基本無保留,，其它代謝物制定工作曲線得到的線性方程相關(guān)系數(shù)均在0.9923～0.9942之間，表明各代謝物在相應(yīng)的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,， 結(jié)果見表4,。
3.5.2 方法的回收率及精密度 由于無法獲得所分析的代謝物引入叔丁基二甲基硅烷基的標(biāo)準(zhǔn)品，衍生化反應(yīng)效率無法確定,，整個(gè)樣品制備過程的回收率無法考察,。本研究按2.2節(jié)方法同時(shí)處理加標(biāo)與未加標(biāo)的基質(zhì)，未加標(biāo)基質(zhì)在衍生化前加入等量標(biāo)準(zhǔn)溶液,，由兩者響應(yīng)的比值計(jì)算回收率,，設(shè)置低、中,、高3個(gè)添加濃度,，結(jié)果見表5。生物體液樣本基質(zhì)較為復(fù)雜,，分析前需要經(jīng)過衍生化反應(yīng),，處理步驟較多,，回收率低于基質(zhì)單一的樣品。3.5.3 基質(zhì)效應(yīng) 采用提取后添加法評定基質(zhì)效應(yīng),。按照2.2節(jié)方法處理尿液基質(zhì),，衍生化前加入標(biāo)準(zhǔn)品溶液，進(jìn)樣后所得峰面積記為A組峰面積,；純?nèi)軇┭苌凹尤霕?biāo)準(zhǔn)品溶液,，進(jìn)樣后所得峰面積記為B組峰面積。以A組峰面積與B組峰面積的比值（A/B）考察基質(zhì)效應(yīng),，4種代謝物的基質(zhì)效應(yīng)在60%～176%之間,，故采用基質(zhì)加標(biāo)工作曲線消除基質(zhì)效應(yīng)的影響。
3.6 氣相色譜質(zhì)譜條件優(yōu)化
根據(jù)目前已有文獻(xiàn)報(bào)道,，本研究嘗試了不同的升溫程序,。優(yōu)化后的色譜圖見圖7，各物質(zhì)峰形良好,，分離效果,。
代謝物衍生化后在EI源中主要的裂解方式見圖7，運(yùn)用Daughter Scan模式,，進(jìn)行子離子掃描,，并對碰撞能量進(jìn)行優(yōu)化，以達(dá)到較高的靈敏度,。3,，5，6TCP在正離子檢測方式下,，基峰為m/z 256,，運(yùn)用Daughter Scan模式，進(jìn)行子離子掃描,， 結(jié)果并未發(fā)現(xiàn)響應(yīng)穩(wěn)定且較強(qiáng)的碎片峰，這與3,，5,，6TCP的環(huán)狀結(jié)構(gòu)特點(diǎn)較為一致。
3.7 樣品分析
采集居住在農(nóng)藥廠附近居民的晨尿樣品40份,，其中兒童尿液樣品20份,，成人尿液樣品20份，按2.2節(jié)中的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行處理,，測定結(jié)果見表6,。
結(jié)果表明，成人尿液樣品DMTP,， DEP,， DETP,， TCP檢出率分別為85%， 90%,， 90%,， 45%，兒童尿液樣品分別為35%,， 75%,， 65%， 60%,。成人尿液中非特異性代謝物DMTP,， DEP， DETP的檢出率均高于兒童,，特異性代謝物TCP的檢出率低于兒童,。結(jié)果表明，居住在農(nóng)藥廠附近的成人與兒童均有不同程度的有機(jī)磷農(nóng)藥內(nèi)暴露,，呼吸可能是造成有機(jī)磷農(nóng)藥內(nèi)暴露的重要途徑,。以尿液中代謝物作為評估有機(jī)磷農(nóng)藥暴露程度的指標(biāo)，成人的暴露量大于兒童,，這是由于成人的呼吸量較大,， 且對農(nóng)藥的代謝能力較強(qiáng)。不同成人與兒童尿液中有機(jī)磷代謝物檢出的差異與其住所位置,、膳食結(jié)構(gòu)等都有密切的關(guān)系,。
4 結(jié) 論
建立了固相萃取氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)分析制尿液中4種OPs代謝物的方法，定量檢測了人體尿液中4種代謝物含量,。本研究采用WCX固相萃取柱,，與液/液萃取相比，耗費(fèi)的有機(jī)溶劑更少,，耗時(shí)更短,，適合于大批量樣品的前處理，為研究人群中低劑量OPs農(nóng)藥暴露情況提供了方法學(xué)基礎(chǔ),。
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