1 引 言
繼有機氯農(nóng)藥被禁用后，有機磷類農(nóng)藥（Organophosphorus pesticides,，OPs）成為國內(nèi)目前農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上應用廣泛,、使用量大的農(nóng)藥[1]。OPs具有易降解,、殺蟲效果好,、抗性不顯著、殘效期較短的特點,，除廣泛應用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中[2],，還常作為除草劑應用于公園、綠地等公共場所,。
OPs進入人體后代謝迅速,，蓄積現(xiàn)象不明顯。OPs由于其結構的相似性,，進入體內(nèi)后一般都能代謝成為6種二烷基磷酸酯（DialkylPhosphates,，DAP）代謝產(chǎn)物中的1種或幾種，在較短的時間內(nèi)隨尿排出[3],，主要有機磷農(nóng)藥代謝產(chǎn)物見表1,。除6種二烷基磷酸酯外，OPs還會產(chǎn)生特殊代謝產(chǎn)物，每種特殊代謝產(chǎn)物通常只由特定的1種或幾種OPs代謝產(chǎn)生,，如毒死蜱,、甲基毒死蜱的特殊代謝產(chǎn)物為3，5,，6三氯2吡啶醇（3,，5，6TCP）,，對硫磷,、甲基對硫磷的特殊代謝產(chǎn)物為對硝基酚，馬拉硫磷的特殊代謝產(chǎn)物為馬拉硫磷二羥基酸[4],。
近年來，農(nóng)藥暴露對人體健康的影響受到廣泛關注[6～9],。根據(jù)OPs代謝較快的特點,，檢測人群尿液樣品中OPs非特異性及特異性代謝物含量可有效評估人體的OPs暴露水平。檢測尿液中OPs代謝物的方法主要有氣相色譜質譜聯(lián)用法[10～12],、氣相色譜串聯(lián)質譜法[13～15],、液相色譜串聯(lián)質譜法[16～18]。液相色譜串聯(lián)質譜法前處理較為簡單,，但實際應用中靈敏度不高,，且基質效應造成的離子抑制比較普遍[19]。提取尿液中DAPs的方法主要有液/液萃取[10～12,，15～17],、固相萃取[13，20],、凍干法[14],。本研究采用固相萃取液/液萃取氣相色譜串聯(lián)質譜技術建立了人體尿液中3種OPs非特異性代謝產(chǎn)物及1種特殊代謝產(chǎn)物的高靈敏檢測方法，避免了液/液萃取使用yi醚對實驗室造成的安全隱患,，實驗時間大幅縮短,，凈化效率優(yōu)于凍干法。本方法為有機磷農(nóng)藥的人體內(nèi)暴露研究提供了良好的技術支撐,。
2 實驗部分
2.1 儀器與試劑
Quattra micro GCMS/MS（美國Waters公司）,；AG285電子天平（瑞士Mettler公司）； MG2200氮吹儀（日本EYELA公司）,；R210旋轉蒸發(fā)器（瑞士Buchi公司）,；WH3微型旋渦混合儀（上海楚定分析儀器有限公司，中國）,；Centrifuge C5804離心機,、恒溫混勻儀（德國 Eppendorf公司）；MilliQ純水器（美國Mimpore公司）。
乙腈,、乙酸乙酯,、甲苯（分析純，南京化學試劑有限公司）,；甲醇,、甲酸（色譜純，德國Merck公司）,；N叔丁基二甲基甲硅烷基N甲基三氟乙酰胺（MTBSTFA,，>97.0%，美國Aldrich公司）,。 其它試劑均為國產(chǎn)分析純,。
Waters Oasis WCX固相萃取柱（150 mg，6 mL）,、Waters Oasis HLB固相萃取柱（200 mg,，6 mL）、Waters Oasis WAX固相萃取柱（60 mg,，3 mL）,，均購自美國Waters公司。
固相萃取DAPs：吸取尿液10.0 mL于100 mL具塞塑料離心管中,，加入100 μL濃HCl,，渦旋1 min，上樣于Waters Oasis WCX固相萃取柱（柱子提前用6 mL甲醇,、6 mL水活化）,，通過固相萃取小柱的尿液樣品收集于100 mL塑料離心管中。上樣后,，干燥,，用8 mL 10%甲酸甲醇溶液洗脫，洗脫液置于10 mL具塞比色管中,。
液/液萃取TCP：通過固相萃取小柱的尿液樣品中加入適量NaOH,，使樣品pH≈7.0，加入2 g NaCl,，渦旋至溶解,，加入20 mL乙酸乙酯乙腈（70∶30， V/V）,，渦旋3 min,，6000 r/min離心5 min。上清液經(jīng)過含適量無水Na2SO4的漏斗轉移至雞心瓶中,，旋蒸濃縮至2 mL左右,。
用移液器將萃取濃縮液移出至含洗脫液的比色管中,，40℃水浴中氮吹至*干燥，比色管中加入0.5 mL甲苯,，渦旋1 min,，轉移至1.5 mL玻璃小管中，加入10 μL 0.2 mg/L內(nèi)標DBP,，20 μL MTBSTFA,，置于90℃恒溫混勻儀中衍生化30 min。
衍生化后的溶液冷卻至室溫,，過0.22 μm有機相濾膜,，供GCMS/MS分析。
2.3 氣相色譜條件
DB5MS色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）,；程序升溫：60℃保持2 min,，以5℃/min升至90℃，以12℃/min升至160℃,，再以10℃/min升至280℃,，保持2 min；進樣量1.0 μL,；不分流進樣,，載氣：氦氣（99.999%）,，流量：1.0 mL/min,，進樣器溫度： 250℃。
2.4 質譜條件正離子模式的電噴霧電離ESI+,，多反應離子監(jiān)測（MRM）,，TCP采用選擇離子檢測（SIM）， EI源轟擊能：70 eV,，離子源溫度：180℃,，傳輸線溫度：250℃，溶劑延遲時間：5.0 min,，碰撞氣：高純氬氣,，保留時間定性，內(nèi)標法定量,。其它質譜參數(shù)見表2,。
3 結果與討論
3.1 基質的選擇
選擇基質時，如采用人工合成尿液進行實驗,，雖然本底較為干凈,，干擾小，但人工尿液中不含蛋白質,，與實際尿液有很大差距,，不能有效反映人體實際尿液基質的復雜性。如采用單個個體尿液作為基質，有的個體存在較高的本底值,，不適合測定方法的建立,。因此，本實驗通過篩選不同個體的尿液,，選擇本底干擾較小的人體尿液作為本實驗的基質,。
3.2 前處理條件優(yōu)化
3.2.1 液/液萃取 文獻報道DAPs和TCP提取均采用液/液萃取的方法，故本實驗首先采用液/液萃取的方法提取DAPs和TCP,。萃取溶劑見表3,，結果見圖2。結果表明,，采取液/液萃取法提取DAPs時,，同一提取方案對不同代謝物提取回收率差別較大，很難找到平衡方案使各代謝物的回收率均符合要求,，TCP的液/液萃取回收率較高,。由于TCP的pKa=7.5，近中性,，故萃取時將溶液調至pH ≈7,，確保萃取時TCP的存在形式為分子態(tài)[18]。
3.2.2 固相萃取柱的選擇
目前文獻所報道的DAPs和TCP提取多采用液/液萃取法,，固相萃取法的報道較少,。本實驗分別考察了親水親油平衡柱（Waters Oasis HLB）、弱陽離子交換柱（Waters Oasis WCX）及弱陰離子交換柱（Waters Oasis WAX）對各代謝物的萃取效果,，結果見圖3,。
Waters Oasis HLB柱雖然適用范圍較廣，可從各種基質中分離出多種酸性,、堿性和中性化合物,，但DMTP回收率過高，其它物質則過低,。Waters Oasis WAX柱為弱陰離子交換柱,，適用于酸性物質， 具有高選擇性,，DAPs為酸性（DMP pKa=1.25,， DMTP pKa=1.37， DEP pKa=1.37,， DETP pKa=1.49）,，但本實驗發(fā)現(xiàn)其對DMP、DEP基本沒有保留,，對DMTP,、DETP雖有保留,，但回收率非常不穩(wěn)定，不適用于從尿液中提取DAPs,，而TCP的pKa近中性,，不易被WAX柱吸附。
Waters Oasis WCX柱對DMTP,、DEP,、DETP、TCP均有保留,，且回收率較穩(wěn)定,。Waters Oasis WCX柱為陽離子交換柱，可吸附帶正電的分子,。DAPs的pKa較低,，呈酸性，實驗中采用強酸酸化并不會使DAPs分子解離,，而分子中的硫原子及氧原子含有孤對電子,，吸引溶液中的氫質子，從而使DAPs分子質子化,，帶正電荷,，可被WCX柱吸附。DMP相比于其它的DAPs,，由于極性較大,，正電性較弱，在WCX柱上基本無保留,。WCX柱對除DMP外的DAPs及TCP均有保留,，故選其作為固相萃取柱,，并對其洗脫條件進行優(yōu)化,。
3.2.3 洗脫條件的優(yōu)化 在洗脫條件的優(yōu)化中，分別考察10%甲酸甲醇溶液,、20%甲酸甲醇溶液,、30%甲酸甲醇溶液，10%甲酸乙腈溶液的洗脫效果,，結果見圖4,。使用10%甲酸甲醇作為洗脫液時，各代謝物回收率在34.9%～77.5%之間（DMP基本無回收）,，高于20%甲酸甲醇溶液得到的回收率,，且較30%甲酸甲醇溶液得到的回收率更為穩(wěn)定。10%甲酸乙腈溶液的洗脫效果與10%甲酸甲醇溶甲醇溶液相當,，TCP基本無回收,。隨著酸度增加,，DAPs的回收率基本都是呈先降低再升高的趨勢。使用10%甲酸甲醇作為洗脫液,，回收率可以接受,，且較為穩(wěn)定。
3.3 固相萃取與液/液萃取的比較
采用表3中方案4作為液/液萃取方法,，與優(yōu)化過的固相萃取方法進行回收率的比較,，結果見圖5。
對于DMTP,， DEP和DETP,，固相萃取的回收率和穩(wěn)定性均高于液/液萃取。對于生物基質樣品分析,，方法的穩(wěn)定性十分重要,。液/液萃取提取TCP的回收率和穩(wěn)定性優(yōu)于固相萃取。用何種提取方法DMP,，結果均不能令人滿意,。終采用固相萃取提取DMTP， DEP和DETP,，采用表3中方案4提取TCP,。
3.4 衍生化反應
本實驗采用硅烷化試劑N（叔丁基二甲基硅烷基）N甲基三氟乙酰胺（MTBSTFA）對目標化合物進行衍生化反應。目標代謝物與衍生化試劑MTBSTFA的反應原理如圖6所示,，通過硅烷化作用將叔丁基二甲基硅烷基引入目標代謝物分子中,，取代分子中的活性氫。
文獻[5,，10,，11，20,，21]采用五氟溴芐苯（PFBBr）對DAPs進行衍生化,，衍生化反應需加入適量K2CO3。與采用PFBBr相比,，MTBSTFA的衍生化反應時間較短（PFBBr衍生化反應需16 h[21]）,，不需要其它試劑參與，不必考慮其它試劑的用量對衍生化效率的影響,。
3.5 方法學驗證
3.5.1 標準曲線及線性范圍 向尿樣中添加目標代謝物混合標準溶液,，按2.2節(jié)中前處理方法進行提取、凈化,，在優(yōu)化后的色譜及質譜條件下進樣,，繪制工作曲線，記錄各待測物色譜峰面積（As）與內(nèi)標色譜峰面積（Ar）,。以各待測物與內(nèi)標的峰面積比R （R= As/As）對濃度（C,，mg/L）進行線性回歸,，確定線性范圍及檢出限、定量限,。檢出限和定量限分別以3和10倍信噪比的濃度來確定,。DMP在固相萃取柱上基本無保留，其它代謝物制定工作曲線得到的線性方程相關系數(shù)均在0.9923～0.9942之間,，表明各代謝物在相應的濃度范圍內(nèi)線性關系良好,， 結果見表4。
3.5.2 方法的回收率及精密度 由于無法獲得所分析的代謝物引入叔丁基二甲基硅烷基的標準品,，衍生化反應效率無法確定,，整個樣品制備過程的回收率無法考察。本研究按2.2節(jié)方法同時處理加標與未加標的基質,，未加標基質在衍生化前加入等量標準溶液,，由兩者響應的比值計算回收率，設置低,、中,、高3個添加濃度，結果見表5,。生物體液樣本基質較為復雜,，分析前需要經(jīng)過衍生化反應，處理步驟較多,，回收率低于基質單一的樣品,。3.5.3 基質效應 采用提取后添加法評定基質效應。按照2.2節(jié)方法處理尿液基質,，衍生化前加入標準品溶液,，進樣后所得峰面積記為A組峰面積；純?nèi)軇┭苌凹尤霕藴势啡芤?，進樣后所得峰面積記為B組峰面積,。以A組峰面積與B組峰面積的比值（A/B）考察基質效應，4種代謝物的基質效應在60%～176%之間,，故采用基質加標工作曲線消除基質效應的影響,。
3.6 氣相色譜質譜條件優(yōu)化
根據(jù)目前已有文獻報道,，本研究嘗試了不同的升溫程序,。優(yōu)化后的色譜圖見圖7，各物質峰形良好,，分離效果,。
代謝物衍生化后在EI源中主要的裂解方式見圖7，運用Daughter Scan模式,，進行子離子掃描,，并對碰撞能量進行優(yōu)化,，以達到較高的靈敏度。3,，5,，6TCP在正離子檢測方式下，基峰為m/z 256,，運用Daughter Scan模式,，進行子離子掃描， 結果并未發(fā)現(xiàn)響應穩(wěn)定且較強的碎片峰,，這與3,，5，6TCP的環(huán)狀結構特點較為一致,。
3.7 樣品分析
采集居住在農(nóng)藥廠附近居民的晨尿樣品40份,，其中兒童尿液樣品20份，成人尿液樣品20份,，按2.2節(jié)中的實驗方法進行處理,，測定結果見表6。
結果表明,，成人尿液樣品DMTP,， DEP， DETP,， TCP檢出率分別為85%,， 90%， 90%,， 45%,，兒童尿液樣品分別為35%， 75%,， 65%,， 60%。成人尿液中非特異性代謝物DMTP,， DEP,， DETP的檢出率均高于兒童，特異性代謝物TCP的檢出率低于兒童,。結果表明,，居住在農(nóng)藥廠附近的成人與兒童均有不同程度的有機磷農(nóng)藥內(nèi)暴露，呼吸可能是造成有機磷農(nóng)藥內(nèi)暴露的重要途徑,。以尿液中代謝物作為評估有機磷農(nóng)藥暴露程度的指標,，成人的暴露量大于兒童，這是由于成人的呼吸量較大,， 且對農(nóng)藥的代謝能力較強,。不同成人與兒童尿液中有機磷代謝物檢出的差異與其住所位置,、膳食結構等都有密切的關系。
4 結 論
建立了固相萃取氣相色譜串聯(lián)質譜同時分析制尿液中4種OPs代謝物的方法,，定量檢測了人體尿液中4種代謝物含量,。本研究采用WCX固相萃取柱，與液/液萃取相比,，耗費的有機溶劑更少,，耗時更短，適合于大批量樣品的前處理,，為研究人群中低劑量OPs農(nóng)藥暴露情況提供了方法學基礎,。
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