首頁 >> 公司動(dòng)態(tài) >> 串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定人體尿液中4種有機(jī)磷農(nóng)藥代謝物
1 引 言
繼有機(jī)氯農(nóng)藥被禁用后，有機(jī)磷類農(nóng)藥（Organophosphorus pesticides,，OPs）成為國內(nèi)目前農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上應(yīng)用廣泛,、使用量大的農(nóng)藥[1]。OPs具有易降解,、殺蟲效果好,、抗性不顯著,、殘效期較短的特點(diǎn)，除廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中[2],，還常作為除草劑應(yīng)用于公園,、綠地等公共場(chǎng)所。
OPs進(jìn)入人體后代謝迅速,，蓄積現(xiàn)象不明顯。OPs由于其結(jié)構(gòu)的相似性,，進(jìn)入體內(nèi)后一般都能代謝成為6種二烷基磷酸酯（DialkylPhosphates,，DAP）代謝產(chǎn)物中的1種或幾種，在較短的時(shí)間內(nèi)隨尿排出[3],，主要有機(jī)磷農(nóng)藥代謝產(chǎn)物見表1,。除6種二烷基磷酸酯外，OPs還會(huì)產(chǎn)生特殊代謝產(chǎn)物,，每種特殊代謝產(chǎn)物通常只由特定的1種或幾種OPs代謝產(chǎn)生,，如毒死蜱、甲基毒死蜱的特殊代謝產(chǎn)物為3,，5,，6三氯2吡啶醇（3，5,，6TCP）,，對(duì)硫磷、甲基對(duì)硫磷的特殊代謝產(chǎn)物為對(duì)硝基酚,，馬拉硫磷的特殊代謝產(chǎn)物為馬拉硫磷二羥基酸[4],。
近年來，農(nóng)藥暴露對(duì)人體健康的影響受到廣泛關(guān)注[6～9],。根據(jù)OPs代謝較快的特點(diǎn),，檢測(cè)人群尿液樣品中OPs非特異性及特異性代謝物含量可有效評(píng)估人體的OPs暴露水平。檢測(cè)尿液中OPs代謝物的方法主要有氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法[10～12],、氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[13～15],、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[16～18]。液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法前處理較為簡(jiǎn)單,，但實(shí)際應(yīng)用中靈敏度不高,，且基質(zhì)效應(yīng)造成的離子抑制比較普遍[19]。提取尿液中DAPs的方法主要有液/液萃取[10～12,，15～17],、固相萃取[13，20],、凍干法[14],。本研究采用固相萃取液/液萃取氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)建立了人體尿液中3種OPs非特異性代謝產(chǎn)物及1種特殊代謝產(chǎn)物的高靈敏檢測(cè)方法,，避免了液/液萃取使用yi醚對(duì)實(shí)驗(yàn)室造成的安全隱患，實(shí)驗(yàn)時(shí)間大幅縮短,，凈化效率優(yōu)于凍干法,。本方法為有機(jī)磷農(nóng)藥的人體內(nèi)暴露研究提供了良好的技術(shù)支撐。
2 實(shí)驗(yàn)部分
2.1 儀器與試劑
Quattra micro GCMS/MS（美國Waters公司）,；AG285電子天平（瑞士Mettler公司）,； MG2200氮吹儀（日本EYELA公司）；R210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（瑞士Buchi公司）,；WH3微型旋渦混合儀（上海楚定分析儀器有限公司,，中國）；Centrifuge C5804離心機(jī),、恒溫混勻儀（德國 Eppendorf公司）,；MilliQ純水器（美國Mimpore公司）。
乙腈,、乙酸乙酯,、甲苯（分析純，南京化學(xué)試劑有限公司）,；甲醇,、甲酸（色譜純，德國Merck公司）,；N叔丁基二甲基甲硅烷基N甲基三氟乙酰胺（MTBSTFA,，>97.0%，美國Aldrich公司）,。 其它試劑均為國產(chǎn)分析純,。
Waters Oasis WCX固相萃取柱（150 mg，6 mL）,、Waters Oasis HLB固相萃取柱（200 mg,，6 mL）、Waters Oasis WAX固相萃取柱（60 mg,，3 mL）,，均購自美國Waters公司。
固相萃取DAPs：吸取尿液10.0 mL于100 mL具塞塑料離心管中,，加入100 μL濃HCl,，渦旋1 min，上樣于Waters Oasis WCX固相萃取柱（柱子提前用6 mL甲醇,、6 mL水活化）,，通過固相萃取小柱的尿液樣品收集于100 mL塑料離心管中。上樣后,，干燥,，用8 mL 10%甲酸甲醇溶液洗脫,，洗脫液置于10 mL具塞比色管中。
液/液萃取TCP：通過固相萃取小柱的尿液樣品中加入適量NaOH,，使樣品pH≈7.0,，加入2 g NaCl，渦旋至溶解,，加入20 mL乙酸乙酯乙腈（70∶30,， V/V），渦旋3 min,，6000 r/min離心5 min,。上清液經(jīng)過含適量無水Na2SO4的漏斗轉(zhuǎn)移至雞心瓶中，旋蒸濃縮至2 mL左右,。
用移液器將萃取濃縮液移出至含洗脫液的比色管中，40℃水浴中氮吹至*干燥,，比色管中加入0.5 mL甲苯,，渦旋1 min，轉(zhuǎn)移至1.5 mL玻璃小管中,，加入10 μL 0.2 mg/L內(nèi)標(biāo)DBP,，20 μL MTBSTFA，置于90℃恒溫混勻儀中衍生化30 min,。
衍生化后的溶液冷卻至室溫,，過0.22 μm有機(jī)相濾膜，供GCMS/MS分析,。
2.3 氣相色譜條件
DB5MS色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）,；程序升溫：60℃保持2 min，以5℃/min升至90℃,，以12℃/min升至160℃,，再以10℃/min升至280℃，保持2 min,；進(jìn)樣量1.0 μL,；不分流進(jìn)樣，載氣：氦氣（99.999%）,，流量：1.0 mL/min,，進(jìn)樣器溫度： 250℃。
2.4 質(zhì)譜條件正離子模式的電噴霧電離ESI+,，多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)（MRM）,，TCP采用選擇離子檢測(cè)（SIM）， EI源轟擊能：70 eV,，離子源溫度：180℃,，傳輸線溫度：250℃,，溶劑延遲時(shí)間：5.0 min，碰撞氣：高純氬氣,，保留時(shí)間定性,，內(nèi)標(biāo)法定量。其它質(zhì)譜參數(shù)見表2,。
3 結(jié)果與討論
3.1 基質(zhì)的選擇
選擇基質(zhì)時(shí),，如采用人工合成尿液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，雖然本底較為干凈,，干擾小,，但人工尿液中不含蛋白質(zhì)，與實(shí)際尿液有很大差距,，不能有效反映人體實(shí)際尿液基質(zhì)的復(fù)雜性,。如采用單個(gè)個(gè)體尿液作為基質(zhì)，有的個(gè)體存在較高的本底值,，不適合測(cè)定方法的建立,。因此，本實(shí)驗(yàn)通過篩選不同個(gè)體的尿液,，選擇本底干擾較小的人體尿液作為本實(shí)驗(yàn)的基質(zhì),。
3.2 前處理?xiàng)l件優(yōu)化
3.2.1 液/液萃取 文獻(xiàn)報(bào)道DAPs和TCP提取均采用液/液萃取的方法，故本實(shí)驗(yàn)首先采用液/液萃取的方法提取DAPs和TCP,。萃取溶劑見表3,，結(jié)果見圖2。結(jié)果表明,，采取液/液萃取法提取DAPs時(shí),，同一提取方案對(duì)不同代謝物提取回收率差別較大，很難找到平衡方案使各代謝物的回收率均符合要求,，TCP的液/液萃取回收率較高,。由于TCP的pKa=7.5，近中性,，故萃取時(shí)將溶液調(diào)至pH ≈7,，確保萃取時(shí)TCP的存在形式為分子態(tài)[18]。
3.2.2 固相萃取柱的選擇
目前文獻(xiàn)所報(bào)道的DAPs和TCP提取多采用液/液萃取法,，固相萃取法的報(bào)道較少,。本實(shí)驗(yàn)分別考察了親水親油平衡柱（Waters Oasis HLB）、弱陽離子交換柱（Waters Oasis WCX）及弱陰離子交換柱（Waters Oasis WAX）對(duì)各代謝物的萃取效果,，結(jié)果見圖3,。
Waters Oasis HLB柱雖然適用范圍較廣，可從各種基質(zhì)中分離出多種酸性,、堿性和中性化合物,，但DMTP回收率過高,，其它物質(zhì)則過低。Waters Oasis WAX柱為弱陰離子交換柱,，適用于酸性物質(zhì),， 具有高選擇性，DAPs為酸性（DMP pKa=1.25,， DMTP pKa=1.37,， DEP pKa=1.37， DETP pKa=1.49）,，但本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其對(duì)DMP,、DEP基本沒有保留，對(duì)DMTP,、DETP雖有保留,，但回收率非常不穩(wěn)定，不適用于從尿液中提取DAPs,，而TCP的pKa近中性,，不易被WAX柱吸附。
Waters Oasis WCX柱對(duì)DMTP,、DEP、DETP,、TCP均有保留,，且回收率較穩(wěn)定。Waters Oasis WCX柱為陽離子交換柱,，可吸附帶正電的分子,。DAPs的pKa較低，呈酸性,，實(shí)驗(yàn)中采用強(qiáng)酸酸化并不會(huì)使DAPs分子解離,，而分子中的硫原子及氧原子含有孤對(duì)電子，吸引溶液中的氫質(zhì)子,，從而使DAPs分子質(zhì)子化,，帶正電荷，可被WCX柱吸附,。DMP相比于其它的DAPs,，由于極性較大，正電性較弱,，在WCX柱上基本無保留,。WCX柱對(duì)除DMP外的DAPs及TCP均有保留，故選其作為固相萃取柱,，并對(duì)其洗脫條件進(jìn)行優(yōu)化,。
3.2.3 洗脫條件的優(yōu)化 在洗脫條件的優(yōu)化中,，分別考察10%甲酸甲醇溶液、20%甲酸甲醇溶液,、30%甲酸甲醇溶液,，10%甲酸乙腈溶液的洗脫效果，結(jié)果見圖4,。使用10%甲酸甲醇作為洗脫液時(shí),，各代謝物回收率在34.9%～77.5%之間（DMP基本無回收），高于20%甲酸甲醇溶液得到的回收率,，且較30%甲酸甲醇溶液得到的回收率更為穩(wěn)定,。10%甲酸乙腈溶液的洗脫效果與10%甲酸甲醇溶甲醇溶液相當(dāng)，TCP基本無回收,。隨著酸度增加,，DAPs的回收率基本都是呈先降低再升高的趨勢(shì)。使用10%甲酸甲醇作為洗脫液,，回收率可以接受,，且較為穩(wěn)定。
3.3 固相萃取與液/液萃取的比較
采用表3中方案4作為液/液萃取方法,，與優(yōu)化過的固相萃取方法進(jìn)行回收率的比較,，結(jié)果見圖5。
對(duì)于DMTP,， DEP和DETP,，固相萃取的回收率和穩(wěn)定性均高于液/液萃取。對(duì)于生物基質(zhì)樣品分析,，方法的穩(wěn)定性十分重要,。液/液萃取提取TCP的回收率和穩(wěn)定性優(yōu)于固相萃取。用何種提取方法DMP,，結(jié)果均不能令人滿意,。終采用固相萃取提取DMTP， DEP和DETP,，采用表3中方案4提取TCP,。
3.4 衍生化反應(yīng)
本實(shí)驗(yàn)采用硅烷化試劑N（叔丁基二甲基硅烷基）N甲基三氟乙酰胺（MTBSTFA）對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行衍生化反應(yīng)。目標(biāo)代謝物與衍生化試劑MTBSTFA的反應(yīng)原理如圖6所示,，通過硅烷化作用將叔丁基二甲基硅烷基引入目標(biāo)代謝物分子中,，取代分子中的活性氫。
文獻(xiàn)[5,，10,，11，20，21]采用五氟溴芐苯（PFBBr）對(duì)DAPs進(jìn)行衍生化,，衍生化反應(yīng)需加入適量K2CO3,。與采用PFBBr相比，MTBSTFA的衍生化反應(yīng)時(shí)間較短（PFBBr衍生化反應(yīng)需16 h[21]）,，不需要其它試劑參與,，不必考慮其它試劑的用量對(duì)衍生化效率的影響。
3.5 方法學(xué)驗(yàn)證
3.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍 向尿樣中添加目標(biāo)代謝物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,，按2.2節(jié)中前處理方法進(jìn)行提取,、凈化，在優(yōu)化后的色譜及質(zhì)譜條件下進(jìn)樣,，繪制工作曲線,，記錄各待測(cè)物色譜峰面積（As）與內(nèi)標(biāo)色譜峰面積（Ar）。以各待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比R （R= As/As）對(duì)濃度（C,，mg/L）進(jìn)行線性回歸,，確定線性范圍及檢出限、定量限,。檢出限和定量限分別以3和10倍信噪比的濃度來確定,。DMP在固相萃取柱上基本無保留，其它代謝物制定工作曲線得到的線性方程相關(guān)系數(shù)均在0.9923～0.9942之間,，表明各代謝物在相應(yīng)的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,， 結(jié)果見表4。
3.5.2 方法的回收率及精密度 由于無法獲得所分析的代謝物引入叔丁基二甲基硅烷基的標(biāo)準(zhǔn)品,，衍生化反應(yīng)效率無法確定,，整個(gè)樣品制備過程的回收率無法考察。本研究按2.2節(jié)方法同時(shí)處理加標(biāo)與未加標(biāo)的基質(zhì),，未加標(biāo)基質(zhì)在衍生化前加入等量標(biāo)準(zhǔn)溶液，由兩者響應(yīng)的比值計(jì)算回收率,，設(shè)置低,、中、高3個(gè)添加濃度,，結(jié)果見表5,。生物體液樣本基質(zhì)較為復(fù)雜，分析前需要經(jīng)過衍生化反應(yīng),，處理步驟較多,，回收率低于基質(zhì)單一的樣品。3.5.3 基質(zhì)效應(yīng) 采用提取后添加法評(píng)定基質(zhì)效應(yīng),。按照2.2節(jié)方法處理尿液基質(zhì),，衍生化前加入標(biāo)準(zhǔn)品溶液，進(jìn)樣后所得峰面積記為A組峰面積,；純?nèi)軇┭苌凹尤霕?biāo)準(zhǔn)品溶液,，進(jìn)樣后所得峰面積記為B組峰面積,。以A組峰面積與B組峰面積的比值（A/B）考察基質(zhì)效應(yīng)，4種代謝物的基質(zhì)效應(yīng)在60%～176%之間,，故采用基質(zhì)加標(biāo)工作曲線消除基質(zhì)效應(yīng)的影響,。
3.6 氣相色譜質(zhì)譜條件優(yōu)化
根據(jù)目前已有文獻(xiàn)報(bào)道，本研究嘗試了不同的升溫程序,。優(yōu)化后的色譜圖見圖7,，各物質(zhì)峰形良好，分離效果,。
代謝物衍生化后在EI源中主要的裂解方式見圖7,，運(yùn)用Daughter Scan模式，進(jìn)行子離子掃描,，并對(duì)碰撞能量進(jìn)行優(yōu)化,，以達(dá)到較高的靈敏度。3,，5,，6TCP在正離子檢測(cè)方式下，基峰為m/z 256,，運(yùn)用Daughter Scan模式,，進(jìn)行子離子掃描， 結(jié)果并未發(fā)現(xiàn)響應(yīng)穩(wěn)定且較強(qiáng)的碎片峰,，這與3,，5，6TCP的環(huán)狀結(jié)構(gòu)特點(diǎn)較為一致,。
3.7 樣品分析
采集居住在農(nóng)藥廠附近居民的晨尿樣品40份,，其中兒童尿液樣品20份，成人尿液樣品20份,，按2.2節(jié)中的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行處理,，測(cè)定結(jié)果見表6。
結(jié)果表明,，成人尿液樣品DMTP,， DEP， DETP,， TCP檢出率分別為85%,， 90%， 90%,， 45%,，兒童尿液樣品分別為35%， 75%， 65%,， 60%,。成人尿液中非特異性代謝物DMTP， DEP,， DETP的檢出率均高于兒童,，特異性代謝物TCP的檢出率低于兒童。結(jié)果表明,，居住在農(nóng)藥廠附近的成人與兒童均有不同程度的有機(jī)磷農(nóng)藥內(nèi)暴露,，呼吸可能是造成有機(jī)磷農(nóng)藥內(nèi)暴露的重要途徑。以尿液中代謝物作為評(píng)估有機(jī)磷農(nóng)藥暴露程度的指標(biāo),，成人的暴露量大于兒童,，這是由于成人的呼吸量較大， 且對(duì)農(nóng)藥的代謝能力較強(qiáng),。不同成人與兒童尿液中有機(jī)磷代謝物檢出的差異與其住所位置,、膳食結(jié)構(gòu)等都有密切的關(guān)系。
4 結(jié) 論
建立了固相萃取氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)分析制尿液中4種OPs代謝物的方法,，定量檢測(cè)了人體尿液中4種代謝物含量,。本研究采用WCX固相萃取柱，與液/液萃取相比,，耗費(fèi)的有機(jī)溶劑更少,，耗時(shí)更短，適合于大批量樣品的前處理,，為研究人群中低劑量OPs農(nóng)藥暴露情況提供了方法學(xué)基礎(chǔ),。
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