1 材料
款冬藥材采自河北蔚縣款冬種植基地,，分別采集2009年9月3日,，10月1日，11月5日,，12月3日及2010年3月4日的款冬花,，陰干備用。經(jīng)山西大學(xué)中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心主任秦雪梅教授鑒定為菊科植物款冬T farfara,，樣品現(xiàn)保存于山西大學(xué)中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心,。
甲醇（天津市登峰化學(xué)試劑廠，批號(hào)20110725272,，純度 995%）,，三氯甲烷（天津市風(fēng)船化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20090223,，純度 990%）,，娃哈哈純凈水，二十四烷（AlfaAesar,， 純度>990%,， 批號(hào)F14S034），MSTFA+1%TMCS?。≒ierce Chemical Company,， USA，批號(hào)101043355）,，正庚烷（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，批號(hào)NK20402000,，純度 995%）,，甲氧胺（上海晶純?cè)噭┯邢薰荆?hào)11190,，純度 985%）,。
Trace PolarisQ氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（配有電噴霧離子源及Xcalibur12數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)美國(guó)Thermo Finnigan公司）,； LD5001電子天平 （沈陽龍騰電子有限公司）,；101系列恒溫干燥箱?。ū本┖屯瑒?chuàng)業(yè)科技有限責(zé)任公司）；RE52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器?。ㄉ虾啒s生化儀器廠）。
2 方法
21 樣品制備
將款冬花樣品液氮研磨至粉末,，稱取樣品30 mg于10 mL玻璃離心管中,，加入CH3ClMeOHH2O?。?∶1∶1） 1 mL，聲提取30 min,，3 000 r·min-1離心30 min，分為上層和下層,。
211 上層（甲醇水層極性部分） 取上清液250 μL,，旋轉(zhuǎn)蒸干，殘?jiān)?0 μL鹽酸甲氧胺吡啶溶液（20 g·L-1）,，70 ℃下反應(yīng)1 h，冷卻至常溫后,，加50 μL MSTFA+1%TMCS,，37 ℃下反應(yīng)30 min,。后加入700 μL 正庚烷（含內(nèi)標(biāo)二十四烷01 g·L-1）,，轉(zhuǎn)移至GC進(jìn)樣小瓶，渦旋1 min,，045 μm微孔濾膜過濾，進(jìn)行GCMS分析,。
212 下層（氯仿層非極性部分） 將所有氯仿層移至25 mL圓底燒瓶中,，旋轉(zhuǎn)蒸干,，加入600 μL的硫酸甲醇溶液（5%）,，50 ℃反應(yīng)30 min,，冷卻至室溫，加入200 μL水和200 μL正庚烷,，振搖使分層，正庚烷層依次用200 μL碳酸氫鈉水溶液（5%）和200 μL的氯化鈉水溶液（5%）洗滌,，正庚烷層加入無水硫酸鈉干燥24 h,，之后將其移出旋轉(zhuǎn)蒸干,，加入200 μL正庚烷（含內(nèi)標(biāo)二十四烷01 g·L-1）,，轉(zhuǎn)移至GC進(jìn)樣小瓶,，渦旋1 min,，045 μm微孔濾膜過濾,，進(jìn)行GCMS分析。
22 色譜條件
221色譜柱 J&W DB5MS毛細(xì)管柱（025 mm×30 m,，025 μm）,；進(jìn)樣口溫度 280 ℃；載氣（He）流速10 mL·min-1,，不分流,。
222 甲醇水層升溫程序 50 ℃保持1 min,，以每分鐘10 ℃升至190 ℃,，保持1 min；以每分鐘3 ℃升至210 ℃,，保持1 min,，后以每分鐘7 ℃升至280 ℃,，保持5 min,。溶劑延遲時(shí)間為4 min，進(jìn)樣量1 μL,。
223 氯仿層升溫程序 50 ℃保持2 min，以每分鐘15 ℃升至160 ℃,，保持1 min,；以每分鐘8 ℃升至210 ℃，保持1 min,，后以每分鐘5 ℃升至280 ℃,，保持5 min,。溶劑延遲時(shí)間為5 min,，進(jìn)樣量2 μL。
23 質(zhì)譜條件
電子轟擊（EI）離子源,；電子能量70 eV,；傳輸線溫度280 ℃；離子源溫度200 ℃,；質(zhì)量掃描范圍m/z 60～800,。
24 數(shù)據(jù)分析
所有的GCMS原始數(shù)據(jù)通過GCMS儀器工作站軟件Xcalibur由RAW格式轉(zhuǎn)化為netCDF格式。GCMS圖譜經(jīng)XCMS軟件預(yù)處理后（XCMS參數(shù)：fwhm75,， snthresh2， max300,， group bw10），導(dǎo)入Excel中對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行面歸一化,，之后將歸一化的數(shù)據(jù)導(dǎo)入代謝組學(xué)軟件SIMCAP 110 軟件包（瑞典,， Umetrics AB， Umea）,，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行ctr標(biāo)準(zhǔn)化之后進(jìn)行主成分分析（principal component analysis,，PCA）和偏小二乘法判別分析（partial least squares discriminant analysis,，PLSDA），通過載荷圖（SPlot loading圖）中的VIP（每個(gè)主成分變量對(duì)分開各組的貢獻(xiàn)大?。﹣韺ふ疑飿?biāo)志物，后通過標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫（NIST05）檢索匹配結(jié)合對(duì)照品對(duì)部分代謝物進(jìn)行指認(rèn),，并通過計(jì)算各個(gè)標(biāo)志物的內(nèi)標(biāo)歸一化后的相對(duì)峰面積含量來進(jìn)行定量分析，并且采用常規(guī)統(tǒng)計(jì)分析SPSS 115軟件進(jìn)行方差分析,，結(jié)果用±s表示,，顯著性差異比較采用t檢驗(yàn),。3 結(jié)果與分析
31 代謝物的指認(rèn)
甲醇水層通過衍生化反應(yīng)得到氨基酸，有機(jī)酸和糖類,，其典型總離子流色譜圖見圖1,；而氯仿層經(jīng)過甲酯化得到的均為非極性小分子和脂肪酸類化合物，其典型總離子流色譜圖見圖2,。氨基酸的指認(rèn)是結(jié)合NIST05數(shù)據(jù)庫，再通過與對(duì)照品的保留時(shí)間和離子碎片對(duì)照而確定的,，見圖3,。目標(biāo)峰在樣品色譜圖中的保留時(shí)間與標(biāo)品的保留時(shí)間一致,，而且離子碎片情況也基本一致，故確定其為天冬酰胺,。其余色譜峰的結(jié)構(gòu)指認(rèn)方法同上,，共指認(rèn)出氨基酸11個(gè)，有機(jī)酸8個(gè),，糖類5個(gè),，脂肪酸10個(gè)和甾醇類化合物2個(gè)，此外還包括香橙烯及其他的一些長(zhǎng)鏈烷烴類低極性化合物,。
圖5表明,，散點(diǎn)圖上可以看出極性部分各個(gè)組與采收期在X軸上均能明顯分開，從Spslot載荷圖（b）中可以得到每2組的差異代謝物,。從圖中可以得到,，在發(fā)育初期的9月，其磷酸,、甘油,、蘋果酸、檸檬酸,、蔗糖和葡萄糖的含量較高,，而發(fā)育中期的脯氨酸和賴氨酸的含量明顯升高；3月款冬樣品與采收期相比,，開花后的脯氨酸,、賴氨酸和蔗糖的含量降低，蘋果酸,、檸檬酸,、果糖和葡萄糖的含量則呈升高的趨勢(shì),。
2個(gè)不同采集月份與傳統(tǒng)采收期的款冬花蕾樣品相比得到的多元統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果見圖6，散點(diǎn)圖上可以看出非極性部分發(fā)育初期和開花后與采收期10—12月份在X軸上均能明顯分開,，從圖6中SPlot載荷圖（b）中可以得到每2組的差異代謝物,。與發(fā)育中期相比,，在發(fā)育初期的9月,，其棕櫚酸,、亞油酸,、亞麻酸,、硬脂酸的含量較高，香橙烯,、花生四烯酸和谷甾醇的含量較低；在開花后的3月,，其亞油酸的含量降低而花生四烯酸和谷甾醇的含量升高。
由以上標(biāo)志代謝物的含量比較可以看出,，差異主要體現(xiàn)在蔗糖,、葡萄糖、脯氨酸,、賴氨酸,、蘋果酸,、檸檬酸、亞油酸,、花生四烯酸和谷甾醇這9個(gè)共同的特征性差異代謝物含量上,，故對(duì)其相對(duì)含量進(jìn)行了t檢驗(yàn)分析和比較,，柱狀圖見圖7。從圖中可明顯看到,，脯氨酸和賴氨酸在花蕾發(fā)育初期含量較低，隨著不斷生長(zhǎng)發(fā)育逐漸升高,，開花后急劇下降,；蘋果酸和檸檬酸在發(fā)育初期較高，中期降低,，開花后回升至接近初期水平；蔗糖的含量是呈逐漸下降趨勢(shì),，在開花后降到低；葡萄糖在發(fā)育初期含量較高,，隨著生長(zhǎng)其含量不斷下降至低，而在開花后又回升至較高水平,；谷甾醇的含量從發(fā)育初期到開花后是逐漸升高的,。亞油酸在發(fā)育初期較低,，逐漸升至高,，開花后顯著降低,；而花生四烯酸則是呈相反的趨勢(shì),，12月份降至低，而在開花后升至高,。
4 討論
崔貴梅等[8]曾對(duì)款冬花序芽的分化過程進(jìn)行了觀察,，結(jié)果表明款冬從7月上旬至10月初經(jīng)歷花芽分化,，因?yàn)榛ㄑ糠只馕吨参飶臓I(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)轉(zhuǎn)向 生長(zhǎng)，因此款冬花在越冬前后一定有營(yíng)養(yǎng)積累和轉(zhuǎn)化的過程。蔗糖是高等植物光合作用的主要產(chǎn)物,，是多數(shù)植物體內(nèi)運(yùn)輸碳水化合物的主要形式,，為植物的生長(zhǎng)發(fā)育提供物質(zhì)和能量,?？疃谖闯鐾恋陌l(fā)育初期9月到出土開花后的3月，蔗糖逐漸轉(zhuǎn)化為其它營(yíng)養(yǎng)和能量物質(zhì),，其含量隨著花蕾的發(fā)育逐漸降低,。有機(jī)酸中的檸檬酸和蘋果酸是三羧酸循環(huán)的重要中間產(chǎn)物,，其含量在發(fā)育初期高,，發(fā)育中期急劇降低,，其含量降低的原因可能在于花蕾的發(fā)育中期需要的能量,，有機(jī)酸轉(zhuǎn)化為糖類為花蕾的發(fā)育提供能量,。在花蕾發(fā)育中期，可能由于所需能量較多,，葡萄糖也參與到能量供應(yīng)中,，通過糖酵解使其發(fā)生氧化而減少。氨基酸屬于植物中的一大類初生代謝產(chǎn)物,，生物體內(nèi)氨基酸的主要作用是合成蛋白質(zhì)或其他含氮化合物,，在植物體內(nèi)，特別是當(dāng)種子萌發(fā)時(shí),，蛋白質(zhì)發(fā)生強(qiáng)烈的降解作用,，產(chǎn)生的氨基酸被重新利用形成幼苗中的蛋白質(zhì),。故在本實(shí)驗(yàn)中,，款冬花蕾樣品中脯氨酸和賴氨酸初期含量較低,，而后逐漸累積升至高,，在開花后又急劇下降，可能是由于在花蕾的生長(zhǎng)發(fā)育初期蛋白質(zhì)分解轉(zhuǎn)化為氨基酸,，故氨基酸逐漸增多，中期含量升至高,，開花后由于能量需求降低氨基酸則又合成為蛋白質(zhì)，故其含量急劇降低,。除此之外,，脂肪酸也是一類重要的能量物質(zhì),，亞油酸在花蕾發(fā)育過程中是呈先升高后降低的趨勢(shì),，而花生四烯酸則是相反的趨勢(shì),，其變化的機(jī)制尚不明確,。
由于款冬花中次生代謝產(chǎn)物含量相對(duì)于初級(jí)代謝產(chǎn)物要低很多,，而且NIST數(shù)據(jù)庫中收載的僅為常見化合物的質(zhì)譜數(shù)據(jù),，因此本實(shí)驗(yàn)中解析的化合物均為初級(jí)代謝產(chǎn)物，下一步將會(huì)采用傳統(tǒng)的植化方法對(duì)款冬花中次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行系統(tǒng)分離,，進(jìn)而通過得到的次生代謝產(chǎn)物對(duì)照品進(jìn)一步指認(rèn)款冬花中的次生代謝產(chǎn)物。
本草記載中款冬花為花蕾未開花時(shí)根據(jù)經(jīng)驗(yàn)方可采收,，并未明確指出具體采收時(shí)期,，目前尚沒有科學(xué)的依據(jù)來做指導(dǎo)，導(dǎo)致市場(chǎng)上款冬花蕾質(zhì)量參差不齊,。本研究從化學(xué)的角度闡明10月,、11月、12月的代謝組成相近,，但合理的采收期還需要通過藥效試驗(yàn)以及分析不同產(chǎn)地以及不同年份種植的樣品進(jìn)一步研究確定,。
通常認(rèn)為，中藥的活性成分為次生代謝產(chǎn)物,，其質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)也多為次生代謝產(chǎn)物,。如2010年版《中國(guó)藥典》中規(guī)定，以款冬酮的含量評(píng)價(jià)款冬花的質(zhì)量,。然而,，中藥中還存在著的初級(jí)代謝產(chǎn)物,，如氨基酸、糖類,、有機(jī)酸和脂肪酸等,。此外，按照中醫(yī)傳統(tǒng),，中藥多以水煎入藥,，在煎出次生代謝產(chǎn)物的同時(shí)，初級(jí)代謝產(chǎn)物也被煎出,?？疃械某跫?jí)代謝產(chǎn)物雖然沒有直接的止咳化痰作用，但是近有研究[15]報(bào)道,，一些氨基酸,、有機(jī)酸和糖類可能作為天然低共溶溶劑（natural deep eutectic solvents，NADES）存在于生物細(xì)胞,，被認(rèn)為是細(xì)胞中的第3種液體,，即天然離子液體。而植物細(xì)胞中包含的次級(jí)代謝產(chǎn)物屬于中等極性的化合物,，如蘆丁,、槲皮素等，其高濃度時(shí)既不溶于水也不溶于脂類（細(xì)胞膜）,，而該研究發(fā)現(xiàn)蘆丁在NADES中的溶解度是水中的50～100倍,。因此，可能作為細(xì)胞內(nèi)天然離子液體的這些初級(jí)代謝產(chǎn)物,，其含量與次生代謝產(chǎn)物的含量有著密切的關(guān)系,。此外，這些初級(jí)代謝產(chǎn)物在中藥內(nèi)存在,，其組成變化直接影響中藥的均一性,，因此，這些化合物的含量雖然與中藥的有效性無直接關(guān)系,，但對(duì)于中藥的均一性控制非常重要,。中藥的作用特點(diǎn)為多成分多靶點(diǎn)協(xié)同作用，這些初生代謝產(chǎn)物對(duì)于藥效發(fā)揮的協(xié)同作用值得進(jìn)一步研究,。
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