本試劑盒只能用于科學(xué)研究,，不得用于醫(yī)學(xué)診斷

嘔吐毒素（DON）ELISA檢測試劑盒

使用說明書

檢測原理

試劑盒采用競爭法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）。往預(yù)先包被嘔吐毒素抗原的包被微孔中,，依次加入標(biāo)本,、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP標(biāo)記的競爭抗原,，經(jīng)過溫育并*洗滌,。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色,。顏色的深淺和樣品中的嘔吐毒素（DON）呈負(fù)相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm 波長下測定吸光度（OD 值）,，計(jì)算樣品濃度,。

樣品收集、處理及保存方法

1.  血清：使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管,，操作過程中避免任何細(xì)胞刺激,，收集血液后，3000轉(zhuǎn)離心10分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離,。

2.  血漿：EDTA,、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000轉(zhuǎn)離心30分鐘取上清,。

3.  細(xì)胞上清液：3000轉(zhuǎn)離心10分鐘去除顆粒和聚合物,。

4.  組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000轉(zhuǎn)離心10分鐘取上清,。

5.  保存：如果樣本收集后不及時(shí)檢測,，請按一次用量分裝，凍存于-20℃,，避免反復(fù)凍融,，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

自備物品

1.酶標(biāo)儀（450nm）

2.高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL,、2-20uL,、20-200uL、200-1000uL

3.37℃恒溫箱

操作注意事項(xiàng)

1.   試劑盒保存在2-8℃,，使用前室溫平衡20分鐘,。從冰箱取出的濃縮洗滌液會有結(jié)晶，這屬于正?，F(xiàn)象,，水浴加熱使結(jié)晶*溶解后再使用。

2.   實(shí)驗(yàn)中不用的板條應(yīng)立即放回自封袋中,，密封（低溫干燥）保存,。

3.   按照說明書操作時(shí)樣本已經(jīng)稀釋5倍，最終結(jié)果乘以5才是樣本實(shí)際濃度,。

4.   嚴(yán)格按照說明書中標(biāo)明的時(shí)間,、加液量及順序進(jìn)行溫育操作。

5.   所有液體組分使用前充分搖勻,。

試劑盒組成

注：標(biāo)準(zhǔn)品（S0-S5）濃度依次為：0,、50、100,、200,、400、800 PPb

試劑的準(zhǔn)備

 20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1：20稀釋,，即1份的20×洗滌緩沖液加19份的蒸餾水,。

洗板方法

1.   手工洗板：甩盡孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液,，靜置1min后甩盡孔內(nèi)液體,，在吸水紙上拍干，如此洗板5次,。

2.   自動洗板機(jī)：每孔注入洗液350μL,，浸泡1min，洗板5次,。

操作步驟

1.  從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條,，剩余板條用自封袋密封放回4℃。

2.  設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔,，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL,；

3.  樣本孔先加待測樣本10μL，再加樣本稀釋液40μL,；空白孔不加,。

4.  除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的競爭抗原50μL,，用封板膜封住反應(yīng)孔,，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。

5.  棄去液體,，吸水紙上拍干,，每孔加滿洗滌液，靜置1min,，甩去洗滌液,，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次（也可用洗板機(jī)洗板）。

6.  每孔加入底物A,、B各50μL,，37℃避光孵育15min。

7.  每孔加入終止液50μL,，15min內(nèi),，在450nm波長處測定各孔的OD值。

結(jié)果判斷

1.  15分鐘內(nèi)在波長450nm的酶標(biāo)儀上讀取各孔的OD值,；

2.  百分結(jié)合率計(jì)算：設(shè)S0管計(jì)數(shù)為B0,，各標(biāo)準(zhǔn)管或樣品管計(jì)數(shù)為B，非特異管計(jì)數(shù)為NSB,，則百分結(jié)合率計(jì)算公式如下：B/B0=(B－NSB)/(B0－NSB)×100%

3.  logit計(jì)算:各標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)或樣品管的logit值計(jì)算公式如下:logit=ln(B/B0)/(1－B/B0)

4.  將標(biāo)準(zhǔn)品的OD均值與標(biāo)準(zhǔn)品0點(diǎn)的OD均相除,，為標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的百分結(jié)合率，在log-logit坐標(biāo)紙上繪圖,。

5.  Log-logit雙對數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線：坐標(biāo)紙上橫軸從左至右第一個(gè)1-9表示為第一個(gè)10進(jìn)位,，第二個(gè)1-9表示為第二個(gè)10進(jìn)位。第三個(gè)1-9表示為第三個(gè)10進(jìn)位,。坐標(biāo)紙縱軸為百分比（1-99）,，即各標(biāo)準(zhǔn)吸光值的百分結(jié)合率。取一條通過各點(diǎn)的直線,。要求盡可能多的點(diǎn)在線上,，同時(shí)剩余的點(diǎn)均勻分布在直線的兩邊。樣品也同樣由吸光值計(jì)算百分結(jié)合率,，再從縱軸上的相應(yīng)結(jié)合率找到直線上的點(diǎn),，此點(diǎn)對應(yīng)的橫坐標(biāo)濃度即為樣品的濃度，無須換算,。

6.  人工處理：以標(biāo)準(zhǔn)濃度取log值為橫坐標(biāo),，對應(yīng)的logit值為縱坐標(biāo)在普通坐標(biāo)紙上或以標(biāo)準(zhǔn)濃度為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的B/B0為縱坐標(biāo)在logit-log坐標(biāo)紙上畫出標(biāo)準(zhǔn)曲線（理想化時(shí)是一條直線）,。根據(jù)待測樣

品的B/B0可以從坐標(biāo)紙上查出樣品的濃度值,。如果使用普通坐標(biāo)紙，查出的數(shù)值應(yīng)取反對數(shù)才是最后的濃度值,。

7.  自動處理：使用logit-log或四參數(shù)數(shù)據(jù)處理模式,，由電腦自動計(jì)算得出結(jié)果。

8.  敏感度：1.0 PPb

9.  圖例

試劑盒性能

1.  準(zhǔn)確性：標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值,，大于等于0.9900,。

2.  靈敏度：最DI檢測濃度小于10 PPb。

3.  特異性：不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類似物交叉反應(yīng),。

4.  重復(fù)性：板內(nèi),、板間變異系數(shù)均小于15%,。

5.  貯藏：2-8℃，避光防潮保存,。

6.  有效期：6個(gè)月

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