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上海源葉生物科技有限公司
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抗原修復(fù)方法
2013-7-22 閱讀(460)
盡管固定對(duì)于組織形態(tài)的保留是*的,，但這一過程對(duì)IHC/ICC檢測(cè)也有不良影響,。固定可能會(huì)改變蛋白的生化特性,，如目的表位被掩蓋,，或不再與一抗結(jié)合。表位的掩蓋可能是由氨基酸與表位的交聯(lián),、表位附近無關(guān)肽段的交聯(lián),、表位構(gòu)象的改變或抗原靜電荷的改變引起的?？乖迯?fù)指的是逆轉(zhuǎn)表位掩蓋和恢復(fù)表位-抗體結(jié)合的技術(shù),。
抗原修復(fù)技術(shù)
抗原修復(fù)的需要取決于多個(gè)變量，包括但不限于,，目的抗原,、所使用的抗體、組織類型,，以及固定方法和持續(xù)時(shí)間,。多克隆抗體能識(shí)別多個(gè)表位，因此即使不進(jìn)行抗原修復(fù),，它們也比單克隆抗體更有可能檢測(cè)到特定抗原,。
目前有多種技術(shù)可恢復(fù)表位的免疫反應(yīng)性。簡(jiǎn)單的方法有改變抗體稀釋液的pH或陽(yáng)離子濃度,，這可能影響抗體與表位的親和力,。對(duì)于部分掩蓋的表位，在開始抗原修復(fù)之前可以先試試改變一抗的孵育條件,。不過,，這一步也需要抗體濃度、孵育時(shí)間和溫度的進(jìn)一步優(yōu)化,。在討論抗體修復(fù)方法時(shí),，技術(shù)通常分為兩大類，蛋白酶誘導(dǎo)的表位修復(fù)（PIER）和熱誘導(dǎo)的表位修復(fù)（HIER）,。一旦優(yōu)化好,，抗原修復(fù)的影響可能是明顯的。
蛋白酶誘導(dǎo)的表位修復(fù)（PIER）
在PIER方法中,，蛋白酶K,、胰蛋白酶和胃蛋白酶等都曾成功恢復(fù)抗體與表位的結(jié)合。人們認(rèn)為作用機(jī)制是切割了可能遮蓋表位的肽段,。PIER的缺點(diǎn)在于恢復(fù)免疫反應(yīng)性的成功率低,，且有可能破壞組織形態(tài)和目的抗原。
熱誘導(dǎo)的表位修復(fù)（HIER）
HIER被認(rèn)為能逆轉(zhuǎn)一些交聯(lián),，并實(shí)現(xiàn)表位二級(jí)或三級(jí)結(jié)構(gòu)的重建,。每種組織、固定方法和待研究抗原的實(shí)驗(yàn)方案必須經(jīng)過優(yōu)化,?？偟膩碚f,，HIER的成功率比PIER要高得多。HIER可利用微波爐,、高壓鍋,、蒸屜、高壓滅菌鍋或水浴開展,。在HIER實(shí)驗(yàn)中,，微波爐是越來越流行的設(shè)備。這些方案大多加熱5分鐘,，然后更換緩沖液,。對(duì)于所有HIER方法，在開始IHC/ICC孵育之前必須讓玻片冷卻,。HIER對(duì)時(shí)間,、溫度、緩沖液和pH特別敏感,，*方法必須根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定,。生物通 www.ebiotrade.com
優(yōu)化與限制
抗原修復(fù)可能需要加強(qiáng)樣品與玻片或蓋玻片的附著。此外,，此技術(shù)對(duì)于冰凍組織切片和酒精固定切片通常過于劇烈,。對(duì)于每種設(shè)備，時(shí)間,、溫度和pH必須經(jīng)過優(yōu)化（如92-95 °C水浴中的5-10分鐘,，相對(duì)120 °C高壓鍋中的1-5分鐘）。為了優(yōu)化抗原修復(fù),，必須開展初步研究,，使用時(shí)間、溫度和pH的各種組合,。在使用抗原修復(fù)方法時(shí),，應(yīng)始終考慮到染色假象的可能性。實(shí)驗(yàn)應(yīng)當(dāng)包含對(duì)照,，以證明特異的抗體結(jié)合,，因?yàn)槿旧Ｊ艿綄?shí)驗(yàn)中多個(gè)變量的影響。
R&D Systems提供了一些試劑,，可改善組織抗原檢測(cè),，并增強(qiáng)免疫反應(yīng)性。在初次優(yōu)化時(shí),，研究人員可比較經(jīng)中性pH 7.0通用抗體修復(fù)液（貨號(hào)CTS015）處理的樣品和未經(jīng)過抗原修復(fù)的同一組織樣品,。之后可能需要使用酸性或堿性的抗原修復(fù)液，這取決于組織,。他們發(fā)現(xiàn),，堿性抗原修復(fù)液（貨號(hào)CTS013）的處理通常很成功。同時(shí)也提供酸性（貨號(hào)CTS014）以及試用裝（貨號(hào)CTS016）的抗原修復(fù)液,。與中性溶液相比,，酸性和堿性抗原修復(fù)液更可能影響組織形態(tài)。
