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上海源葉生物科技有限公司
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對照的重要性
2013-7-22 閱讀(928)
適當(dāng)?shù)膶φ諏τ贗HC/ICC結(jié)果的準確闡釋至關(guān)重要,。令人滿意的IHC/ICC實驗設(shè)計可產(chǎn)生結(jié)果,，說明抗原位于正確的組織,、細胞類型或亞細胞定位,。固定,、封閉,、抗體孵育和抗原修復(fù)步驟的優(yōu)化將產(chǎn)生強烈而特異的信號,。然而,，有時實驗也會出現(xiàn)假象哦，蒙蔽了你的雙眼,。因此,，IHC/ICC實驗必須包含陽性和陰性對照。
此外,，抗體特異性,、實驗條件、組織類型之間生物學(xué)條件,、甚至研究人員的差異都可能產(chǎn)生不一致的染色,，導(dǎo)致不準確的結(jié)論。為了實現(xiàn)性能一致,，詳細記錄是IHC/ICC研究的一個重要因素,。在此，我們介紹了一些*的對照,，可支持您IHC/ICC結(jié)果的特異性,。
內(nèi)源組織背景對照
某些細胞和組織可能有著固有的生物學(xué)性質(zhì)，產(chǎn)生背景染色,，從而導(dǎo)致結(jié)果的誤讀,。在一抗上樣之前，應(yīng)利用熒光（適用于熒光標記）或明視場（適用于顯色標記）照明在顯微鏡下檢查細胞和組織,，以確保組織本身沒有信號,。例如，脂褐質(zhì)是一種內(nèi)源的自發(fā)熒光色素,，可與陽性染色混淆,。
無一抗對照
將組織與抗體稀釋液孵育，其中不包含一抗的對照通常也是必需的,。之后與二抗和檢測試劑孵育,。只用檢測試劑染色應(yīng)該是可以忽略的，它不會掩蓋特異染色，也不會類似于特異染色的模式,。
同型對照
在使用單克隆一抗時,，可利用此對照。將樣品與抗體稀釋液孵育,，并添加與一抗相同亞型（如IgG1,、IgG2A、IgG2B,、IgM）和濃度的非免疫球蛋白,。之后將樣品與二抗和檢測試劑孵育。這些步驟將確保特異染色所出現(xiàn)的不是由免疫球蛋白分子與樣品的非特異相互作用引起的,。背景染色應(yīng)該是可以忽略的,，與特異染色不同。
吸附對照
體與免疫原預(yù)孵育,。這會使抗體失活,，組織應(yīng)該無染色或很少染色?？乖c抗體的混合物應(yīng)以10:1（摩爾比）配制,，并在4 °C預(yù)孵育guoye。
隨后將預(yù)吸附的抗體與組織共同孵育,，以取代一抗,。將一抗產(chǎn)生的染色模式與預(yù)吸附抗體產(chǎn)生的相比較。
如果免疫原是肽段,，那么吸附對照效果更好,。不過，如果抗體是由整個蛋白產(chǎn)生的,，則抗體與蛋白混合物的添加可能導(dǎo)致更高的非特異染色,。盡管機理還不清楚，但有可能是預(yù)吸附所用的抗原本身與組織結(jié)合,，產(chǎn)生非特異染色,。因此，必須注意,，使用整個蛋白的吸附對照不一定能驗證抗體與組織中蛋白結(jié)合的特異性,。
大鼠背根神經(jīng)節(jié)中的吸附對照。A. 利用anti-human phospho-MSK1親和純化過的多克隆抗體（貨號AF1036）對大鼠背根神經(jīng)節(jié)冰凍切片中的磷酸化MSK1（S212）進行染色,。B. 如果抗體用S212磷酸化免疫原預(yù)先吸附,，則細胞核染色（箭頭所指）不見了,。
組織類型對照
IHC/ICC實驗的其他對照包括使用已知表達（或不表達）目的表位的組織樣品,。這種策略可提供有用的參考，也可使用在初步優(yōu)化研究中,。來自轉(zhuǎn)基因動物的組織特別有用,，它們表達或不表達抗原,。此外，不同物種的組織樣品也可包含在內(nèi),，以支持抗體的物種特異性,。
Western Blot有必要嗎？
人們常常開展Western blot實驗,，以補充或支持IHC/ICC研究,。不過，在變性過程中蛋白構(gòu)象的變化可能產(chǎn)生誤導(dǎo)性的結(jié)果,。對于某一特定抗體,，Western blot與IHC/ICC研究之間的不一致可能只是反映出實驗條件的差異。由于多克隆抗體識別多個表位,，故沒那么容易產(chǎn)生這種實驗假象,。
