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上海源葉生物科技有限公司
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免疫組化DAB法 顯示過氧化物酶
2012-8-4 閱讀(1588)
〔原理〕 過氧化物酶分解H2O2的過程中,，下面反應(yīng)不直接發(fā)生：AH2（供氫體）+H2O2→A（供氫體的氧化物）+2H2O2實驗可知,，有稱為復(fù)合物 Ⅰ、Ⅱ,、Ⅲ,、的酶——底物（受氫體）復(fù)合體生成,，在復(fù)合體zui后分解為酶和水時，游離的原子氧使供氫體氧化而顯色,。酶組織化學(xué)中所使用的供氫體應(yīng)是含有色原性基團的發(fā)色物質(zhì),，如奈酚和聯(lián)苯胺。
免疫組化染色步驟（以ABC法為例）
溶液的配置：
1. 0.1M PBS 2000ml：NaCL 18g, NaH2PO4·2H2O 0.8g, Na2HPO4·12H2O 12g. 共六份
2. 檸檬酸鹽緩沖液：
貯存液：0.1M檸檬酸溶液（A）：21.01g 檸檬酸 + 1L 蒸餾水
0.1M檸檬酸三鈉溶液（B）：29.41g 檸檬酸三鈉 + 1L 蒸餾水
工作液：9ml A液+41ml B液+450ml 蒸餾水→0.01M檸檬酸鹽緩沖液
3. 0.03% H2O2-甲醇：30% H2O2 0.4ml + 400ml 純甲醇→充分混勻
4. 20% 甘油：80ml 純甘油 + 320ml 蒸餾水
5. 稀釋抗體：1︰300 ,，1︰400 ,，1︰600 （臨用前配）
6. 酒精的配置
染色步驟：一步法
1. 載玻片 烤箱中 60℃ 40′。
2. 二甲苯Ⅰ,，60℃ 20′（水浴箱中）,，二甲苯Ⅱ，室溫 15′,。
3. 脫水,，100%→95%→85%→75%酒精，每級均為3′,。
4. 蒸餾水沖洗,，PBS 5′﹡1
5. 微波爐修復(fù)抗原：0.01M 檸檬酸鹽緩沖液，99℃ 肺 20′,，心腎 12′
6. PBS 3′*3
7. 0.03% H2O2-甲醇,，室溫20′
8. PBS沖洗，PBS 3′*3,，甩干或紙巾吸去多余液體（勿碰到組織）,，PAP Pen劃境線,。
9. block solution 封閉抗原，室溫10′,。
10. 傾出封閉液,，不洗，滴加一抗（60ul）,，4℃過夜或37℃ 1～2h,。
11. PBS沖洗，3′*3,。
12. 除去PBS,，滴加A增強劑，室溫25′,。
13. PBS沖洗,，3′*3。
14. 除去PBS,，滴加B劑，室溫35′,。
15. PBS沖洗,，3′*3。同時配置DAB顯色劑,。
16. 除去PBS,，DAB顯色10′（在顯微鏡下觀察染色程度控制染色時間）。蒸餾水沖洗,。
17. 復(fù)染：蘇目素均勻滴加2滴,，40′′，蒸餾水沖洗,，60℃溫水泡半分鐘,。
18. 脫水：75%酒精→85%→95%→100%（3次），每級3′,。
19. 透明：二甲苯Ⅰ3′,，二甲苯Ⅱ3′。
18. 封片：中性樹脂,，加蓋玻片（組織部位切勿殘留小氣泡）,，60℃ 0.5h烘干。
結(jié)果：棕褐色反應(yīng)產(chǎn)物代表抗原X的定位,。
拍照
1. 更換樣品時,，除了調(diào)整焦距和視野外，顯微鏡上的其他部件都不能動,！所有的樣品必須一次拍攝*,。特別是在拍攝過程中,，不要一會用高倍鏡，一會用低倍鏡,，來回切換物鏡,。
2. 數(shù)碼相機必須設(shè)置為手動曝光，并且保持每張照片用同樣的曝光條件,，同樣的曝光時間,，同樣的光圈。特別要注意的是,，一定要將數(shù)碼相機的自動白平衡功能給關(guān)掉
3. 免疫組化切片一般染色不太深,，因此拍攝出的照片顏色較淺，就讓它淺,。拍攝出的照片中空白部位應(yīng)盡可能呈現(xiàn)純白色,。測量其灰度應(yīng)在250左右。如果呈現(xiàn)淡藍色,，一般是相機自動白平衡在起作用,。另外一個因素是顯微鏡燈光電壓不正確。要使燈光本身的色溫正確,。既不偏黃,，也不偏藍。
