日韩av大片在线观看欧美成人不卡|午夜先锋看片|中国女人18毛片水多|免费xx高潮喷水|国产大片美女av|丰满老熟妇好大bbbbbbbbbbb|人妻上司四区|japanese人妻少妇乱中文|少妇做爰喷水高潮受不了|美女人妻被颜射的视频,亚洲国产精品久久艾草一,俄罗斯6一一11萝裸体自慰,午夜三级理论在线观看无码

【基本原理】
IL-2的生物活性檢測(cè)法是檢測(cè)IL-2對(duì)靶細(xì)胞（或反應(yīng)細(xì)胞）的促增殖作用的能力,。IL-2反應(yīng)細(xì)胞增殖程度可以增殖細(xì)胞中DNA合成或酶活性為指示系統(tǒng),，通過(guò)測(cè)定3H-TdRDNA摻入量或MTT比色法OD值,，并通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照，間接測(cè)定IL-2的生物活性單位,。以下三類(lèi)細(xì)胞可作為IL-2的檢測(cè)細(xì)胞：①I(mǎi)L-2依賴(lài)細(xì)胞株,，如CTLL，CTLL-2,，尤以后者zui常用,；②有絲分裂原活化的T淋巴母細(xì)胞；③小鼠胸腺細(xì)胞,。下面主要介紹以CTLL-2細(xì)胞作為反應(yīng)細(xì)胞檢測(cè)IL-2的生物學(xué)活性,，又包括MTT比色法與3H-TdR摻入量?jī)煞N基本方法，其原理參見(jiàn)IL-1的生物活性檢測(cè)部分,。
【材料和試劑】
（1） CTLL-2細(xì)胞：作為反應(yīng)細(xì)胞或靶細(xì)胞,。
（2） 待測(cè)樣品：從1:2開(kāi)始作倍比稀釋?zhuān)辽?個(gè)稀釋度。
（3） IL-2標(biāo)準(zhǔn)品：同上作倍比稀釋?zhuān)辽?個(gè)不同稀釋度
（4） 10% FCS-RPMI-1640*培養(yǎng)液
（5） MTT：用PBS配成濃度為5mg/ml的MTT溶液,，用0.22μm濾膜過(guò)濾除菌及雜質(zhì),，4℃避光保存。
（6） 酸化異丙醇：100ml異丙醇中加入0.4ml 36%HCl即可成為0.04mol/L HCl的異丙醇,。
（7） 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,，刻度吸管、毛細(xì)吸管,，加樣器（頭）,，刻度離心管，離心機(jī),，細(xì)胞計(jì)數(shù)板,，倒置顯微鏡，超凈工作臺(tái),，CO2培養(yǎng)箱,，酶標(biāo)測(cè)定儀，570nm和630nm濾光片,。
【操作步驟】
（1） 用10% FCS-RPMI-1640*培養(yǎng)液洗滌CTLL-2細(xì)胞2次,，1000r/min離心5min，以去除原生長(zhǎng)培養(yǎng)液（含有IL-2）,；
（2） 用10%FCF-RPMI-RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)細(xì)胞濃度為1×105/ml,；
（3） 將不同倍比稀釋度的IL-2的標(biāo)準(zhǔn)品及待測(cè)樣品分別加入96孔培養(yǎng)板中，100μl/孔，各設(shè)3復(fù)孔,，并同時(shí)設(shè)培養(yǎng)液對(duì)照,；
（4） 各孔內(nèi)均加入CTLL-2細(xì)胞懸液，100μl/孔,；
（5） 置37℃,，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h（18-24h均可）；
（6） 細(xì)胞培養(yǎng)至18-24h時(shí),，各孔加入MTT溶液,，10μl /孔繼續(xù)培養(yǎng)4h；
（7） 取出培養(yǎng)板,，先從各孔中輕輕吸出100μl上清液棄去,。再加入酶化異丙醇或DMSO，100μl/孔,，置室溫10-20min,，吹打震蕩，充分混勻,，使MTT-甲肷產(chǎn)物充分溶解,；
（8） 用酶標(biāo)儀的檢測(cè)波長(zhǎng)570nm，參考波長(zhǎng)630nm,，分別測(cè)定各孔OD值,，測(cè)定應(yīng)在加入酸化異丙醇后1h內(nèi)完成。
【結(jié)果分析】
（1） 每孔OD值應(yīng)取3復(fù)孔的平均值,，zui終各孔OD值應(yīng)為OD570nm-OD630nm,，再減去培養(yǎng)液對(duì)照孔OD值；
（2） 按概率單位分析法計(jì)算IL-2活性單位（參見(jiàn)IL-1的生物活性檢測(cè)法部分）：樣品IL-2活性單位采用下列公式計(jì)算：
樣品IL-2活性單位（U/ml） = 達(dá)標(biāo)準(zhǔn)品zui大OD值50%的樣品稀釋度 × 標(biāo)準(zhǔn)品IL-2活性單位
（U/ml）
達(dá)zui大OD值50%對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋度

【注意事項(xiàng)】
（1） CTLL-2細(xì)胞存活率應(yīng)＞95%（細(xì)胞折光性好,，形態(tài)飽滿(mǎn)）,，洗滌時(shí)操作不要太猛烈，因CTLL-2細(xì)胞膜極脆,，容易破碎而影響檢測(cè)結(jié)果,。
（2） CTLL-2細(xì)胞要充分洗滌，因原生長(zhǎng)培養(yǎng)液中含有IL-2,。
（3） CTLL-2細(xì)胞對(duì)鼠IL-4亦有增殖反應(yīng),，若樣品中含有鼠IL-4，將影響檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性,，此時(shí)可用抗鼠IL-4 McAb處理待測(cè)樣品后再進(jìn)行檢測(cè),。但CTLL-2細(xì)胞對(duì)人IL-4無(wú)增殖反應(yīng)。
（4） CTLL-2的*終濃度宜為1×104/孔,，且應(yīng)均勻分布,。
（5） CTLL-2細(xì)胞凍存后復(fù)蘇較為困難,，而長(zhǎng)期培養(yǎng)又易產(chǎn)生變異而干擾IL-2活性測(cè)定，應(yīng)加以注意,。
（6） IL-2標(biāo)準(zhǔn)品及待測(cè)樣品從1:2開(kāi)始至少6個(gè)倍比稀釋度,，加樣時(shí)應(yīng)從低濃度到高濃度順序加入，且不可共用加樣器頭,。
（7） 加入MTT的*時(shí)間應(yīng)為培養(yǎng)液對(duì)照（無(wú)IL-2）孔細(xì)胞全部死亡時(shí),，一般時(shí)間是細(xì)胞培養(yǎng)至18-24h時(shí)。
（8） 加入酶化異丙醇后,，應(yīng)在1h內(nèi)進(jìn)行OD測(cè)定,。如果1h內(nèi)無(wú)法測(cè)定,，可將未加酸化異丙醇的96孔培養(yǎng)板暫時(shí)放入4℃冰箱保存,。測(cè)定前，取出置室溫下數(shù)分鐘,，再加入酶化異丙醇進(jìn)行OD值測(cè)定,。
（9） 因RPMI-1640培養(yǎng)液中含有的酚紅可干擾OD值測(cè)定，而加入酶化后的異丙醇,，可使培養(yǎng)液中的酚紅在酸性條件下由紅色變成黃色,，從而可排除紅色對(duì)OD值測(cè)定的干擾；此外,，設(shè)立培養(yǎng)液對(duì)照,，可進(jìn)一步排除培養(yǎng)液對(duì)OD值測(cè)定的影響。
（10） IL-2活性單位計(jì)算方法有多種,，除在IL-1活性單位計(jì)算法中所述的方法外,，還可通過(guò)正態(tài)概率紙法、概率單位法計(jì)算IL-2活性單位,，亦可對(duì)結(jié)果進(jìn)行計(jì)算機(jī)處理,，得出IL-2的活性單位。有關(guān)計(jì)算方法可參閱醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)學(xué)的有關(guān)內(nèi)容,。