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上海源葉生物科技有限公司
主營產(chǎn)品： S30260異硫氰酸胍,30259鹽酸胍,嗜熱菌蛋白酶 |
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3H-TdR摻入法檢測IL-2的生物活性
2012-3-10 閱讀(1185)
【材料和試劑】
（1） 反應(yīng)細胞：CTLL-2，存活率應(yīng)＞95%。
（2） IL-2標準品：倍比稀釋為不同濃度。
（3） 待測樣品：倍比稀釋為不同濃度。
（4） 10% Fcs-RPMI-1640*培養(yǎng)液
（5） 3H-TdR
（6） 96孔培養(yǎng)板，刻度吸管,，毛細吸管，刻度離心管,，離心機,，加樣器（頭），細胞計數(shù)板,，倒置顯微鏡,，超凈工作臺，CO2培養(yǎng)箱,，微量細胞收集儀,，玻璃纖維濾紙，ß液閃計數(shù)儀,。
【操作步驟】
（1） 用10 %FCS-RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌CTLL-2細胞2次,，1000r/min離心5min，以去除原生長培養(yǎng)液（含IL-2）,；
（2） 用10% Fcs-RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)細胞濃度為1×105/ml,；
（3） 將不同倍比稀釋度的IL-2的標準品和待測樣品分別加入96孔細胞培養(yǎng)板，100μL/孔,，各設(shè)3復(fù)孔,，同時設(shè)培養(yǎng)液對照；
（4） 各孔均加入CTLL-2細胞懸液,，100μl/孔 ,；
（5） 置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h,；
（6） 每孔均加入3H-TdR,，0.5μci/孔 ,，繼續(xù)培養(yǎng)4-6h,；
（7） 用微量細胞收集儀收集細胞于玻璃纖維紙上,，用ß液閃計數(shù)儀測定各孔cpm值。測定CPM值的*時間應(yīng)是培養(yǎng)液對照（無IL-2）細胞全部或大部分死亡而加有IL-2孔細胞生長旺盛時,。
【結(jié)果分析】
（1） 每孔cpm值為了復(fù)孔的平均值,，再減去培養(yǎng)液對照，即為各孔zui終c
（2） 計算IL-2活性單位（參見IL-1,、IL-2的MTT比色檢測法）可按下式計算：
| 樣品IL-2活性單位 （U/ml） | = | 達50%zui大增殖3H-TdR滲入值的樣品稀釋度 | × | 標準品IL-2活性單位 （U/ml） |
| 達50%zui大增殖3H-TdR滲入值的標準品稀釋度 |
【注意事項】
（1） 用125I-UdR代替3H-TdR進行IL-2活性檢測,。其優(yōu)點是不需ß液體閃爍測定所需的試劑和設(shè)備，只需一臺小型γ計數(shù)儀即可,，并可節(jié)省時間和減少ß液體閃爍操作中出現(xiàn)的誤差,。其缺點是125I-UdR半衰期較短，需要定期供應(yīng),?；痉椒ㄍ?sup>3H-TdR摻入法，只是用125I-UdR代替3H-TdR,，0.2μci/孔 ,，然后再加入1mmol/L的5-氟尿嘧啶5μl，繼續(xù)培養(yǎng)24h,，收集細胞用γ計數(shù)儀測定cpm值,。
（2） 其余注意事項可參見MTT法檢測IL-2活性部分。
