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上海源葉生物科技有限公司
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尼帕病毒病的病毒分離和鑒定判定標(biāo)準(zhǔn)
2011-6-18 閱讀(733)
NiV和亨爪病毒（Hendravirus,，HeV）非常類似,，此兩種病毒在各種免疫學(xué)檢測中大多數(shù)都存在交叉反應(yīng),，因此,，各種實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)中各種免疫學(xué)檢測都不能作為尼帕病毒病確診的依據(jù),。
①樣品的采集,、運(yùn)輸和保存。診斷用的樣品采集和運(yùn)輸必須注意生物安全防護(hù),。將診斷用樣品運(yùn)送到國外時(shí),，必須遵守我國相關(guān)的出入境法律法規(guī)，以及航空運(yùn)輸協(xié)會(huì)的危險(xiǎn)物品運(yùn)輸規(guī)定,。動(dòng)物可能帶有病毒的組織樣品包括腦,、肺、腎,、脾,、肝、淋巴結(jié),。這些臟器都應(yīng)采樣送檢,。采集的樣品應(yīng)該在冰上或4℃下運(yùn)輸，用干冰,。在一20℃下保存不宜太久,。
②用細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行病毒分離。在無菌情況下處理待測樣品,。用密閉的勻漿器處理含10g／100ml組織樣品的懸浮液,，如在密閉的金屬筒中用可以高壓滅菌的金屬球進(jìn)行研磨，或者在罩／袋式勻漿器中用塑料袋進(jìn)行研磨,。樣品磨碎后,，300g離心，將上清加入到培養(yǎng)的細(xì)胞體系中。NiV在很多種類的細(xì)胞中都容易生長,，這有利于病毒分離,。非洲綠猴腎細(xì)胞（Vero細(xì)胞）和兔腎細(xì)胞（RK-13）對NiV非常敏感。病毒感染細(xì)胞后的第3天出現(xiàn)CPE,，如果沒有出現(xiàn)CPE,，應(yīng)該再盲傳2次，每次培養(yǎng)5天,。在低感染比情況下,，NiV特征性CPE是出現(xiàn)細(xì)胞融合現(xiàn)象，經(jīng)過24～48h,，有些融合的細(xì)胞可含有60個(gè)以上的細(xì)胞核,。后期，NiV感染Vero細(xì)胞形成的融合細(xì)胞的細(xì)胞核分布在融合細(xì)胞的周圍,。
③病毒的鑒定（RT-PCR方法）,。用第七章的RT-PCR方法可以達(dá)到快速簡便地鑒定分離的病毒是否為NiV。如果發(fā)現(xiàn)RT-PCR檢測陽性的病料來自以前沒有報(bào)道過NiV疫情的地區(qū),，必須對RT-PCR陽性擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序,，并核實(shí)序列是NiV序列后才達(dá)到病毒的鑒定目的。
④病毒的鑒定（VNT方法）,。VNT采用引起50％細(xì)胞培養(yǎng)孔發(fā)生CPE的TCID50判定法,。標(biāo)準(zhǔn)的NiV樣品以及待測的NiV樣品稀釋到每50fuL約含有100個(gè)TCID50的病毒。然后把它們加到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（平底）中,，然后加上等體積EMEM培養(yǎng)基,、倍比稀釋的NiV標(biāo)準(zhǔn)的抗血清，在37℃作用45min后,，每孔加上2．4X104個(gè)Vero細(xì)胞,，zui終每個(gè)孔大約200／AL。37℃培養(yǎng)3天后,，觀察CPE,。那些只加有細(xì)胞的孔，以及只加有細(xì)胞和抗血清的孔都不應(yīng)出現(xiàn)CPE,。相反,，那些加有細(xì)胞和病毒的孔都應(yīng)該出現(xiàn)CPE（細(xì)胞融合、死亡）,。如果分離的病毒可以被標(biāo)準(zhǔn)的陽性血清中和,，則分離的病毒可以判定為NiV類似的病毒；如果分離的病毒不能被標(biāo)準(zhǔn)的陽性血清中和,，則分離的病毒判定為不是NiV,。
疑似病例的判定標(biāo)準(zhǔn)
尼帕病毒病的疑似病例的判定標(biāo)準(zhǔn)是以下3項(xiàng)中任意1項(xiàng),，并且此陽性結(jié)果得到國家外來動(dòng)物疫病診斷中心的確認(rèn)。
*項(xiàng)：NiV特異性抗原免疫組化檢測陽性,。
第二項(xiàng)：抗NiV血清抗體的VNT檢測陽性,，NiV抗血清中和。
第三項(xiàng)：抗NiV血清抗體的ELISA檢測陽性或從病料中分離的病毒能夠被標(biāo)準(zhǔn)的抗
此外,，根據(jù)上述第二項(xiàng)，可以判定被檢動(dòng)物感染或曾經(jīng)感染了NiV類似的病毒,。
確診病例的判定標(biāo)準(zhǔn)
尼帕病毒病的確診病例的判定標(biāo)準(zhǔn)足以下2項(xiàng)中任意1項(xiàng)并且此陽性結(jié)果得到國家外,，來動(dòng)物疫病診斷中心的確認(rèn)。
*項(xiàng)：臨床病料中分離到NiV,。
第二項(xiàng)：RT-PCR檢測出NiV特異性核酸,。
注意：上述第二項(xiàng)必須*排除實(shí)驗(yàn)室核酸污染的可能性。
