當前位置:上海一基實業(yè)有限公司>>技術文章>>IL-17的檢測
IL-17是新近被確認的一種細胞因子,,由T細胞,,主要是CD4+T細胞產生,其靶細胞廣泛,??杉せ钷D錄因子NF-KB,誘導纖維母細胞產生IL-6、ID8,、GM-CSF,、和膜性細胞間粘附分子1(1CAM-1),促進由亞適劑量PHA所誘導的T細胞增殖,。目前編碼IL-17及其受體的基因核苷酸序列已被部分測定,。
(1)IL-17的誘導:取人PBMC或純化的CD4+T細胞,加入誘導劑(PMA 5ng/mL+ionomycin 3ug/mL,,或ConA 63ug/mL,,或抗CD28抗體+CD3抗體),37℃孵育48—72h,。收集培養(yǎng)上清液檢測IL-17含量(ELISA法)或生物學活性,。
(2)IL-17生物學活性檢測:通過誘導類風濕性關節(jié)炎滑膜細胞或腎癌上皮細胞株(TUMT或CHA)產生IL-6、IL-8或GM-CSF可以檢測IL-17的活性,。
1)滑膜細胞的制備:外科切取關節(jié)滑膜,,剪碎后用4ug/mL膠原酶消化,37~C孵育2~3h,,單個細胞懸液用培養(yǎng)液培養(yǎng),。細胞貼壁后,洗去未粘附細胞,。待細胞生長至匯合,,用胰蛋白酶消化傳代。一般采用3—8代的滑膜成纖維樣細胞作為檢測用靶細胞,。
2)取96孔細胞培養(yǎng)板,,每孔依次加人104滑膜細胞或是TUMT細胞(或CHA細胞),不同稀釋度的IL-17待測樣品,,總體積為200uL,,置370(2 5%C02溫箱中孵育48h,收集上清,,置-20℃保存以備檢測細胞因子活性,。用ELISA法或生物學活性測定法檢測上清液中的II-6、IL-8或GM-CSF等細胞因子的含量或活性,,以此推測IL-17的活性
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