你知道內(nèi)切酶實(shí)驗(yàn)的注意事項(xiàng)有哪些嗎？讓我們一起來(lái)看看吧,！

一,、限制性內(nèi)切酶一般反應(yīng)條件

當(dāng)進(jìn)行限制性酶切反應(yīng)時(shí),，為確保最佳的反應(yīng)條件，務(wù)必要遵守限制性內(nèi)切酶供應(yīng)商提供的建議,。在此過(guò)程中需要考慮的重要參數(shù)包括：底物 (DNA) 和酶的量,、反應(yīng)體積以及孵育時(shí)間,。

根據(jù)傳統(tǒng)的定義，在最佳反應(yīng)條件下,，一個(gè)單位的限制性內(nèi)切酶可以在1小時(shí)內(nèi),，在50μL體系中 wan全酶切1μL 定義底物（例如，質(zhì)粒 pUC19）,。盡管單位定義提供了一種測(cè)定方式，但還需注意,，根據(jù) DNA 底物之中的識(shí)別序列出現(xiàn)的頻率及所用底物類型,，針對(duì)不同DNA底物使用等量的限制性內(nèi)切酶可能需要不同的最佳反應(yīng)條件。實(shí)際上,，酶供應(yīng)商往往根據(jù) DNA 樣本的潛在質(zhì)量,、數(shù)量和性質(zhì)波動(dòng)，推薦比wan全酶切所需量多5至20倍的酶（或1μL 酶/反應(yīng)體積）,。

二、星號(hào)活性

星號(hào)或“松弛"活性是限制性內(nèi)切酶的一種固有性質(zhì),，即在非最you反應(yīng)條件下,，限制性內(nèi)切酶可能會(huì)作用于與其天然識(shí)別位點(diǎn)存在細(xì)微差異的識(shí)別序列。例如,，如下圖所示，EcoRI 可以識(shí)別和切割位點(diǎn)5’-GAATTC-3’,，但其星號(hào)活性可能導(dǎo)致序列在5’-TAATTC-3’和5’-CAATTC-3’處被切割,。同樣，BamHI 除了可切割其正常的識(shí)別序列 5’-GGATCC-3’ 外,，還可切割 5’-NGATCC-3’,、5’-GPuATCC-3’和 5’-GGNTCC-3’（其中 N 代表任意核苷酸）,。

需特別指出，在最佳反應(yīng)條件下,，“星號(hào)"位點(diǎn)的切割率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于正常的識(shí)別位點(diǎn)（大約相差 105–106）,。因此,，酶切期間出現(xiàn)星號(hào)活性的常見(jiàn)原因?yàn)橄拗菩詢?nèi)切酶過(guò)量和/或孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)（過(guò)度酶切）。此外,，高濃度甘油（例如,，>5%）,、低濃度鹽、非最佳 pH,、存在有機(jī)溶劑,，以及除 Mg2+ 之外的二價(jià)陽(yáng)離子都可能造成底物 DNA 的非特異性切割。使用酶制造商推薦的實(shí)驗(yàn)方案和緩沖液,，可避免出現(xiàn)星號(hào)活性,。

三,、不wan全酶切

不wan全酶切是在限制性內(nèi)切酶使用過(guò)程中常遇到的問(wèn)題之一。當(dāng)酶量過(guò)多或過(guò)少時(shí),，都可能發(fā)生不wan全酶切,。DNA 樣本中存在污染物也可能導(dǎo)致不wan全酶切。緩沖液組分,、孵育時(shí)間和反應(yīng)溫度等欠佳的反應(yīng)條件是不wan全酶切的常見(jiàn)原因,。

部分限制性內(nèi)切酶需要輔因子才能實(shí)現(xiàn)wan全活性。例如,，Esp3I (BsmBI) 需要 DTT，而 Eco57I (AcuI) 需要 S-腺苷甲硫胺酸,。AarI 和 BveI (BspMI) 等部分限制性內(nèi)切酶需要兩個(gè)拷貝的識(shí)別位點(diǎn)才能實(shí)現(xiàn)有效切割,；針對(duì)這一類酶，通常向反應(yīng)物之中添加一份帶有識(shí)別位點(diǎn)的寡核苷酸來(lái)增強(qiáng)酶活性,。

除了反應(yīng)條件和酶性質(zhì)外,，DNA 自身的性質(zhì)也會(huì)影響限制性酶切,。甲基化的 DNA 可耐受部分限制性內(nèi)切酶的切割（詳見(jiàn)甲基化部分）。酶的識(shí)別位點(diǎn)過(guò)于接近終端（線性底物 DNA 中）以及切割位點(diǎn)相鄰（雙酶切）都可能影響酶切割 DNA 的效率）,。此外,，部分超螺旋 DNA 分子要比線性 DNA 分子更難切割，增加 5-10 倍的酶量可有助實(shí)現(xiàn)wan全酶切,。

四,、酶切圖譜不正常

即便遵守了制造商的使用說(shuō)明，仍可能觀察到預(yù)料之外的底物 DNA 切割結(jié)果,。為避免陷入此類困境,，必須確保酶和 DNA、反應(yīng)所用的試劑均不含污染物（例如,，其它限制性內(nèi)切酶、DNA 和核酸酶）,。

出現(xiàn)預(yù)料之外切割的一個(gè)原因是，在增殖和擴(kuò)增過(guò)程中,，底物 DNA 引入了突變,。突變可能破壞已知的識(shí)別位點(diǎn)或創(chuàng)造出新的識(shí)別位點(diǎn)，從而產(chǎn)生預(yù)料之外的酶切結(jié)果,。對(duì) DNA 進(jìn)行Sanger 測(cè)序,，是一種判斷突變是否引起底物 DNA 出現(xiàn)預(yù)期外切割的有效方法。

有時(shí)候預(yù)期之外的酶切圖譜是由檢測(cè)過(guò)程而非酶切過(guò)程造成的,。部分限制性內(nèi)切酶（例如，F(xiàn)okI,，TauI）可能會(huì)與 DNA 緊密結(jié)合,，導(dǎo)致電泳時(shí)出現(xiàn)明顯的凝膠遷移。使用含 SDS 的上樣染料,，加熱使酶從切割的 DNA 上解離開(kāi)來(lái)，均可避免出現(xiàn)這類凝膠遷移現(xiàn)象,。