Hoechst 33342/PI雙染試劑盒
細胞凋亡熒光Hoechst33342/PI雙染試劑盒
（Apoptotic Cell Hoechst 33342/PI Detection Kit）
Store at4℃ for one year
Expire date：
一、試劑盒說明
熒光染料Hoechst 33342能少許進入正常細胞膜,，使其染上低藍色,，而凋亡細胞的膜通透性增強，因此進入凋亡細胞中的Hoechst 33342比正常細胞的多,，熒光強度要比正常細胞中要高,，此外，凋亡細胞的染色體DNA的結構發(fā)生了改變從而使該染料能更有效地與DNA結合,，并且凋亡細胞膜上的p-糖蛋白泵功能受到損傷不能有效地將Hoechst 33342排出到細胞外使之在細胞內(nèi)積累增加等都使凋亡細胞的藍色熒光增強,。而PI染料是不能進入細胞膜完整的正常細胞和凋亡細胞中，即活細胞對PI染料拒染,，而壞死細胞由于膜完整性在早期即已破損,，可被PI染料染色。根據(jù)這些特性,，用Hoechst 33342結合PI染料對凋亡細胞進行雙染色,，就可在流式細胞儀上將正常細胞、凋亡細胞和壞死細胞區(qū)別開來,。在雙變量流式細胞儀的散點圖上,，這三群細胞表現(xiàn)分別為：正常細胞為低藍色/低紅色（Hoechst 33342+/PI+），凋亡細胞為高藍色/低紅色（Hoechst 33342++/PI+）,，壞死細胞為低藍色/高紅色（Hoechst 33342+/PI++）,。
二,、試劑盒組份
| 組份 | KGA212（100 assays） | 儲存條件 |
| Heochst 33342 染液 | 1.0mL | 4℃,，避光 |
| Propidium Iodide （PI） | 500μL | 4℃,，避光 |
| 10×Buffer A | 10 mL | 4℃ |
注: Buffer A工作液配制用：雙蒸水將10×Buffer A稀釋10倍。
三,、試劑盒以外自備儀器和試劑
熒光顯微鏡或流式細胞儀,、低速離心機、微量移液器,、1.5m L Microtube,、載玻片、蓋玻片
四,、使用注意事項
1． 在紅色熒光對蘭色熒光散點圖上,，還可見到細胞凋亡區(qū)向細胞壞死區(qū)遷移的軌跡，可能是凋亡細胞的DNA進一步降解的緣故,。
2． 用Heochst 33342染料與細胞孵育的時間不宜過長,，一般控制在20min之內(nèi)為宜。如果太長可引起Heochst 33342的發(fā)射光譜由藍光向紅光的遷移,，導致紅色熒光與蘭色熒光的比例改變,，從而影響結果的判斷。
2． 用Heochst 33342染料與細胞孵育的時間不宜過長,，一般控制在20min之內(nèi)為宜。如果太長可引起Heochst 33342的發(fā)射光譜由藍光向紅光的遷移,，導致紅色熒光與蘭色熒光的比例改變,，從而影響結果的判斷。
3．Propidium Iodide （PI）有毒,，操作時要戴手套,。
五、操作方法
1．懸浮生長的細胞離心收集,，固定培養(yǎng)的細胞消化收集后,，將105~106個細胞懸浮于1mL培養(yǎng)基中，再加入10μL Heochst 33342 染液,，混勻,，370C孵育5～15 min；
2．細胞于 40C ,，500～1000r/min離心5min棄去上清液,；
3．加入1.0mLBuffer A工作液（用雙蒸水將10×Buffer A稀釋10倍）懸浮細胞，加入5μL PI染液,，室溫避光放置5～15min后混勻,；
4．熒光顯微鏡觀察：
2．細胞于 40C ,，500～1000r/min離心5min棄去上清液,；
3．加入1.0mLBuffer A工作液（用雙蒸水將10×Buffer A稀釋10倍）懸浮細胞，加入5μL PI染液,，室溫避光放置5～15min后混勻,；
4．熒光顯微鏡觀察：
Heochst 33342用氪激光激發(fā)的紫外光，激發(fā)波長為352nm,，發(fā)射波長為400～500nm,，產(chǎn)生蘭色熒光；PI用氬離子激光激發(fā)熒光,，激發(fā)光波波長為488nm,，發(fā)射光波波長大于630nm，產(chǎn)生紅色熒光,。
5．流式細胞儀分析：
Heochst 33342用氪激光激發(fā)的紫外光,，激發(fā)波長為352nm,，發(fā)射波長為400～500nm，產(chǎn)生蘭色熒光,；PI用氬離子激光激發(fā)熒光,，激發(fā)光波波長為488nm，發(fā)射光波波長大于630nm,，產(chǎn)生紅色熒光,。分析蘭色熒光對紅色熒光的散點圖或地形圖。結果判斷：在蘭色熒光對紅色熒光的散點圖上,，結果為：正常細胞為低藍光/低紅光,，凋亡細胞為高藍光/低紅光，壞死細胞為低藍光/高紅光,。
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