細胞凋亡熒光Hoechst33342/PI雙染試劑盒
(Apoptotic Cell Hoechst 33342/PI Detection Kit)
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Expire date:
一、試劑盒說明
熒光染料Hoechst 33342能少許進入正常細胞膜,,使其染上低藍色,,而凋亡細胞的膜通透性增強,因此進入凋亡細胞中的Hoechst 33342比正常細胞的多,,熒光強度要比正常細胞中要高,,此外,凋亡細胞的染色體DNA的結構發(fā)生了改變從而使該染料能更有效地與DNA結合,,并且凋亡細胞膜上的p-糖蛋白泵功能受到損傷不能有效地將Hoechst 33342排出到細胞外使之在細胞內(nèi)積累增加等都使凋亡細胞的藍色熒光增強,。而PI染料是不能進入細胞膜完整的正常細胞和凋亡細胞中,即活細胞對PI染料拒染,,而壞死細胞由于膜完整性在早期即已破損,,可被PI染料染色。根據(jù)這些特性,,用Hoechst 33342結合PI染料對凋亡細胞進行雙染色,,就可在流式細胞儀上將正常細胞、凋亡細胞和壞死細胞區(qū)別開來,。在雙變量流式細胞儀的散點圖上,,這三群細胞表現(xiàn)分別為:正常細胞為低藍色/低紅色(Hoechst 33342+/PI+),凋亡細胞為高藍色/低紅色(Hoechst 33342++/PI+),,壞死細胞為低藍色/高紅色(Hoechst 33342+/PI++),。
二,、試劑盒組份
組份 | KGA212(100 assays) | 儲存條件 |
Heochst 33342 染液 | 1.0mL | 4℃,,避光 |
Propidium Iodide (PI) | 500μL | 4℃,,避光 |
10×Buffer A | 10 mL | 4℃ |
注: Buffer A工作液配制用:雙蒸水將10×Buffer A稀釋10倍。
三,、試劑盒以外自備儀器和試劑
熒光顯微鏡或流式細胞儀,、低速離心機、微量移液器,、1.5m L Microtube,、載玻片、蓋玻片
四,、使用注意事項
1. 在紅色熒光對蘭色熒光散點圖上,,還可見到細胞凋亡區(qū)向細胞壞死區(qū)遷移的軌跡,可能是凋亡細胞的DNA進一步降解的緣故,。
2. 用Heochst 33342染料與細胞孵育的時間不宜過長,,一般控制在20min之內(nèi)為宜。如果太長可引起Heochst 33342的發(fā)射光譜由藍光向紅光的遷移,,導致紅色熒光與蘭色熒光的比例改變,,從而影響結果的判斷。
3.Propidium Iodide (PI)有毒,,操作時要戴手套,。
五、操作方法
1.懸浮生長的細胞離心收集,,固定培養(yǎng)的細胞消化收集后,,將105~106個細胞懸浮于1mL培養(yǎng)基中,再加入10μL Heochst 33342 染液,,混勻,,370C孵育5~15 min;
2.細胞于 40C ,,500~1000r/min離心5min棄去上清液,;
3.加入1.0mLBuffer A工作液(用雙蒸水將10×Buffer A稀釋10倍)懸浮細胞,加入5μL PI染液,,室溫避光放置5~15min后混勻,;
4.熒光顯微鏡觀察:
Heochst 33342用氪激光激發(fā)的紫外光,激發(fā)波長為352nm,,發(fā)射波長為400~500nm,,產(chǎn)生蘭色熒光;PI用氬離子激光激發(fā)熒光,,激發(fā)光波波長為488nm,,發(fā)射光波波長大于630nm,產(chǎn)生紅色熒光,。
5.流式細胞儀分析:
Heochst 33342用氪激光激發(fā)的紫外光,,激發(fā)波長為352nm,,發(fā)射波長為400~500nm,產(chǎn)生蘭色熒光,;PI用氬離子激光激發(fā)熒光,,激發(fā)光波波長為488nm,發(fā)射光波波長大于630nm,,產(chǎn)生紅色熒光,。分析蘭色熒光對紅色熒光的散點圖或地形圖。結果判斷:在蘭色熒光對紅色熒光的散點圖上,,結果為:正常細胞為低藍光/低紅光,,凋亡細胞為高藍光/低紅光,壞死細胞為低藍光/高紅光,。