PCR的用途及使用方法

真核生物的基因組是DNA，為什么不直接從DNA PCR得到我們需要的基因呢,？因?yàn)檎婧松锏幕蚝写罅康姆蔷幋a區(qū),，稱(chēng)為內(nèi)元（intron），真正編碼蛋白的區(qū)段是被這些內(nèi)元隔開(kāi)的,，這些編碼區(qū)叫做外元（exon）,。真核生物的DNA轉(zhuǎn)錄成為RNA之后，經(jīng)過(guò)剪切和拼接,，去掉這些非編碼區(qū),，才形成成熟的mRNA，由mRNA再翻譯成蛋白質(zhì),。

所以,，如果直接從真核生物的基因組DNA獲取目的基因，克隆再表達(dá),，試圖獲取目的蛋白的思路是行不通的,，因?yàn)楂@取的DNA里面會(huì)含有非編碼區(qū)。要表達(dá)真核生物的基因并表達(dá)出相應(yīng)的蛋白,，只能通過(guò)提取其mRNA并RT-PCR這條頗費(fèi)周折的途徑,。

1．RNA的提取

RNA的提取其實(shí)原理很簡(jiǎn)單：通過(guò)變性劑破碎細(xì)胞或者組織，然后經(jīng)過(guò)氯仿等有機(jī)溶劑抽提RNA,，再經(jīng)過(guò)沉淀,，洗滌，晾干,，后溶解,。但是由于RNA酶無(wú)處不在，隨時(shí)可能將RNA降解,，所以實(shí)驗(yàn)中有很多地方需要注意,，稍有疏忽就會(huì)前功盡棄,。

1．1 分離高質(zhì)量RNA

成功的cDNA合成來(lái)自高質(zhì)量的RNA。高質(zhì)量的RNA至少應(yīng)保證全長(zhǎng)并且不含逆轉(zhuǎn)錄酶的抑制劑,，如EDTA或SDS,。RNA的質(zhì)量決定了你能夠轉(zhuǎn)錄到cDNA上的序列信息量的大值。一般的RNA純化方法是使用異硫氰酸胍／酸性酚的一步法,。

一般不必使用oligo（dT）選擇性分離poly（A）+RNA,。不管起始模板是總RNA還是poly（A）+ RNA，都可以檢測(cè)到擴(kuò)增結(jié)果,。另外,，分離poly（A）+RNA會(huì)導(dǎo)致樣品間mRNA豐度的波動(dòng)變化，從而使信息的檢出和定量產(chǎn)生偏差,。然而,，當(dāng)分析稀有mRNA時(shí)，poly（A）+RNA會(huì)增加檢測(cè)的靈敏度,。

1．2 RNA提取的大影響因素-RNA酶

在所有RNA實(shí)驗(yàn)中,，關(guān)鍵的因素是分離得到全長(zhǎng)的RNA。而實(shí)驗(yàn)失敗的主要原因是核糖核酸酶（RNA酶）的污染,。由于RNA酶廣泛存在而穩(wěn)定,，可耐受多種處理而不被滅活，如煮沸,、高壓滅菌等,，RNA酶催化的反應(yīng)一般不需要輔助因子。因而RNA制劑中只要存在少量的RNA酶就會(huì)引起RNA在制備與分析過(guò)程中的降解,，而所制備的RNA的純度和完整性又可直接影響RNA分析的結(jié)果,，所以RNA的制備與分析操作難度很大。

在實(shí)驗(yàn)中,，一方面要嚴(yán)格控制外源性RNA酶的污染,；另一方面要大限度地抑制內(nèi)源性的RNA酶。外源性的RNA酶存在于操作人員的手汗,、唾液等，也可存在于灰塵中,。在其它分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中使用的RNA酶也會(huì)造成污染,。這些外源性的RNA酶可污染器械、玻璃制品,、塑料制品,、電泳槽、研究人員的手及各種試劑,。而各種組織和細(xì)胞中則含有大量?jī)?nèi)源性的RNA酶,。

1．3 常用的RNA酶抑制劑

*焦碳酸二乙酯（DEPC）：是一種強(qiáng)烈但不*的RNA酶抑制劑,。它通過(guò)和RNA酶的活性基團(tuán)組氨酸的咪唑環(huán)結(jié)合使蛋白質(zhì)變性，從而抑制酶的活性,。

*異硫氰酸胍：目前被認(rèn)為是有效的RNA酶抑制劑,，它在裂解組織的同時(shí)也使RNA酶失活。它既可破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)使核酸從核蛋白中解離出來(lái),，又對(duì)RNA酶有強(qiáng)烈的變性作用,。

*氧釩核糖核苷復(fù)合物：由氧化釩離子和核苷形成的復(fù)合物，它和RNA酶結(jié)合形成過(guò)渡態(tài)類(lèi)物質(zhì),，幾乎能*抑制RNA酶的活性,。

*RNA酶的蛋白抑制劑（RNasin）：從大鼠肝或人胎盤(pán)中提取得來(lái)的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一種非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑,，可以和多種RNA酶結(jié)合,，使其失活。

*其它：SDS,、尿素,、硅藻土等對(duì)RNA酶也有一定抑制作用。

1．4 防止RNA酶污染的措施,、RNA提取之前需要注意和準(zhǔn)備的工作

*盡可能在實(shí)驗(yàn)室專(zhuān)門(mén)辟出RNA操作區(qū),，離心機(jī)、移液器,、試劑等均應(yīng),。RNA操作區(qū)應(yīng)保持清潔，并定期進(jìn)行除菌,。

*操作過(guò)程中應(yīng)始終戴一次性橡膠手套和口罩,，并經(jīng)常更換，以防止手,、臂上的細(xì)菌和真菌以及人體自身分泌的RNase帶入各種容器內(nèi)或污染用具,。盡量避免使用一次性塑料手套。塑料手套不僅常常給操作帶來(lái)不便,，而且塑料手套的多出部分常常將器具有RNase處傳遞到RNase-free處,，擴(kuò)大污染。

*盡量使用一次性的塑料制品,，避免共用器具如濾紙,、tips、tubes等,，以防交叉污染,。例如，從事RNA探針工作的研究者經(jīng)常使用RNase H、T1等,，在操作過(guò)程中極有可能造成移液器,、離心機(jī)等的污染。而這些污染了的器具是RNA操作的大敵,。

*關(guān)于一次性塑料制品,，建議使用廠家供應(yīng)的出廠前已經(jīng)滅菌的tips和tubes等。多數(shù)廠家供應(yīng)的無(wú)菌塑料制品很少有RNase污染,，買(mǎi)來(lái)后可直接用于RNA操作,。用DEPC等處理的塑料制品，往往由于二次污染而帶有RNase,，從而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗,。

*所有的玻璃器皿均應(yīng)在使用前于180℃的高溫下干烤6hr或更長(zhǎng)時(shí)間。

*無(wú)法用DEPC處理的用具可用氯仿擦拭若干次,，這樣通?？梢韵齊Nase的活性。

*配制溶液用的乙醇,、異丙醇,、Tris等應(yīng)采用未開(kāi)封的新瓶裝試劑。

*塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿沖洗（注意：有機(jī)玻璃器具因可被氯仿腐蝕,，故不能使用）,。

*有機(jī)玻璃的電泳槽等，可先用去污劑洗滌,，雙蒸水沖洗,，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2 室溫10min,，然后用0.1% DEPC水沖洗,，晾干。

*配制的溶液應(yīng)盡可能的用0.1% DEPC,，在37℃處理12hr以上,。然后用高壓滅菌除去殘留的DEPC。不能高壓滅菌的試劑,，應(yīng)當(dāng)用DEPC處理過(guò)的無(wú)菌雙蒸水配制,，然后經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾除菌。

1．5 RNA提取的一般步驟

RNA提取的一般步驟是：破碎組織→分離RNA→沉淀RNA→洗滌RNA→融解RNA→保存RNA

破碎組織和滅活RNA酶可以同步進(jìn)行,，可以用鹽酸胍,、硫氰酸胍、NP-40,、SDS、蛋白酶K等破碎組織，加入β-ME可以抑制RNA酶活性,。

分離RNA一半用酚,、氯仿等有機(jī)溶劑，加入少量異戊醇,，經(jīng)過(guò)此步,，離心，RNA一般分布于上層,，與蛋白層分開(kāi),。

沉淀RNA一般用乙醇、3M NaAc（pH-5.2）或異丙醇,。

洗滌RNA使用70％乙醇洗滌,，有時(shí)，為避免RNA被洗掉,，此步可以省掉,，洗滌之后可以晾干或者烤干乙醇，但是不能過(guò)于干燥,，否則不易溶解,。

融解RNA一般使用TE。

保存RNA應(yīng)該盡量低溫,。為了防止痕量RNase的污染,，從富含RNase的樣品（如胰臟、肝臟）中分離到的RNA需要貯存在甲醛中以保存高質(zhì)量的RNA,，對(duì)于長(zhǎng)期貯存更是如此,。從大鼠肝臟中提取的RNA，在水中貯存一個(gè)星期就基本降解了,，而從大鼠脾臟中提取的RNA,，在水中保存3年仍保持穩(wěn)定。另外,，長(zhǎng)度大于4kb的轉(zhuǎn)錄本對(duì)于痕量RNase的降解比小轉(zhuǎn)錄本更敏感,。為了增加貯存RNA樣品的穩(wěn)定性，可以將RNA溶解在去離子的甲酰胺中,，存于-70℃,。用于保存RNA的甲酰胺一定不能含有降解RNA的雜物。來(lái)源于胰臟的RNA至少可以在甲酰胺中保存一年,。當(dāng)準(zhǔn)備使用RNA時(shí),，可以使用下列方法沉淀RNA：加入NaAc至0.3M，12,000×g離心5分鐘,。

1．6RNA抽提新方法-TRIZOL法

TRIZOL試劑是直接從細(xì)胞或組織中提取總RNA的試劑,。它在破碎和溶解細(xì)胞時(shí)能保持RNA的完整性,。加入氯仿后離心，樣品分成水樣層和有機(jī)層,。RNA存在于水樣層中,。收集上面的的水樣層后，RNA可以通過(guò)異丙醇沉淀來(lái)還原,。在除去水樣層后,，樣品中的DNA和蛋白也能相繼以沉淀的方式還原。乙醇沉淀能析出中間層的DNA,，在有機(jī)層中加入異丙醇能沉淀出蛋白,。共純化DNA對(duì)于樣品間標(biāo)準(zhǔn)化RNA的產(chǎn)量十分有用。

TRIZOL是有毒物,，接觸皮膚或者不慎吞服,，會(huì)導(dǎo)致灼傷，一旦接觸皮膚后立即以大量的洗滌劑和清水清洗,。TRIZOL在室溫下能穩(wěn)定保存12個(gè)月,。盡管如此，為達(dá)到佳效果,，建議保存在2-8°C的環(huán)境下,。

2．RT-PCR

RT-PCR是指將逆轉(zhuǎn)錄（Reverse Transcription；RT）反應(yīng)和PCR （Polymerase Chain Reaction）反應(yīng)組合在一起的方法,。

2．1 RT-PCR的原理

RT-PCR將以RNA為模板的cDNA合成同PCR結(jié)合在一起,，提供了一種分析基因表達(dá)的快速靈敏的方法。RT-PCR用于對(duì)表達(dá)信息進(jìn)行檢測(cè)或定量,。另外,，這項(xiàng)技術(shù)還可以用來(lái)檢測(cè)基因表達(dá)差異或不必構(gòu)建cDNA文庫(kù)克隆cDNA。RT-PCR比其他包括Northern印跡,、RNase保護(hù)分析,、原位雜交及S1核酸酶分析在內(nèi)的RNA分析技術(shù)，更靈敏,，更易于操作,。

RT-PCR的模板可以為總RNA或poly（A）+選擇性RNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)可以使用逆轉(zhuǎn)錄酶,，以隨機(jī)引物,、oligo（dT）或基因特異性的引物（GSP）起始。RT-PCR可以一步法或兩步法的形式進(jìn)行,。在兩步法RT-PCR中,，每一步都在佳條件下進(jìn)行。cDNA的合成首先在逆轉(zhuǎn)錄緩沖液中進(jìn)行,，然后取出1/10的反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行PCR,。在一步法RT-PCR中,，逆轉(zhuǎn)錄和PCR在同時(shí)為逆轉(zhuǎn)錄和PCR優(yōu)化的條件下，在一只管中順次進(jìn)行,。

2．2 RT-PCR的步驟

⑴在冰浴離心管里面加入模板RNA 4uL,，引物2uL，去離子水5uL,，混勻，離心3-5秒,；

⑵70度水浴5分鐘,，冰浴30秒（此處是為了使引物和模板正確配對(duì)）；

⑶加入5×反應(yīng)液4uL,，RNase抑制劑1uL,，dNTP 2uL（這些應(yīng)該先配好，然后分再裝到每一管）,，混勻,；

⑷37度水浴5分鐘，加入1uL AMV-RT反轉(zhuǎn)錄酶,，混勻,；

⑸37度水浴1小時(shí)（此步是反轉(zhuǎn)錄過(guò)程）；

⑹70度10分鐘結(jié)束反應(yīng)（此處是滅活酶活性,，避免對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生干擾）,，產(chǎn)物置冰上進(jìn)行下一步PCR實(shí)驗(yàn)，余下的-70度保存,。

2．3 RT-PCR的引物設(shè)計(jì)

RT-PCR引物設(shè)計(jì)和一般PCR引物設(shè)計(jì)可以遵循同樣的原則,。細(xì)心地進(jìn)行引物設(shè)計(jì)是PCR中重要的一步。理想的引物對(duì)只同目的序列兩側(cè)的單一序列而非其他序列退火,。設(shè)計(jì)糟糕的引物可能會(huì)同擴(kuò)增其他的非目的序列,。設(shè)計(jì)理想的引物都有以下共同的特點(diǎn)，而設(shè)計(jì)失敗的引物則各有各的缺點(diǎn)：

* 典型的引物18到24個(gè)核苷長(zhǎng),。引物需要足夠長(zhǎng),，保證序列*性，并降低序列存在于非目的序列位點(diǎn)的可能性,。但是長(zhǎng)度大于24核苷的引物并不意味著更高的特異性,。較長(zhǎng)的序列可能會(huì)與錯(cuò)誤配對(duì)序列雜交，降低了特異性,，而且比短序列雜交慢,，從而降低了產(chǎn)量。

* 選擇GC含量為40％到60％或GC含量反映模板GC含量的引物,。

* 設(shè)計(jì)5'端和中間區(qū)為G或C的引物,。這會(huì)增加引物的穩(wěn)定性和引物同目的序列雜交的穩(wěn)定性,。

* 避免引物對(duì)3'末端存在互補(bǔ)序列，這會(huì)形成引物二聚體,，抑制擴(kuò)增,。

* 避免3'末端富含GC。設(shè)計(jì)引物時(shí)保證在后5個(gè)核苷中含有3個(gè)A或T,。

* 避免3'末端的錯(cuò)誤配對(duì),。3'端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸。

* 避免存在可能會(huì)產(chǎn)生內(nèi)部二級(jí)結(jié)構(gòu)的序列,，這會(huì)破壞引物退火穩(wěn)定性,。

目的序列上并不存在的附加序列，如限制位點(diǎn)和啟動(dòng)子序列,，可以加入到引物5'端而不影響特異性,。當(dāng)計(jì)算引物Tm值時(shí)并不包括這些序列，但是應(yīng)該對(duì)其進(jìn)行互補(bǔ)性和內(nèi)部二級(jí)結(jié)構(gòu)的檢測(cè),。

引物的穩(wěn)定性依賴于儲(chǔ)存條件,。應(yīng)將干粉和溶解的引物儲(chǔ)存在-20℃。以大于10μM濃度溶于TE的引物在-20℃可以穩(wěn)定保存6個(gè)月,，但在室溫（15℃到30℃）僅能保存不到1周,。干粉引物可以在-20℃保存至少1年，在室溫（15℃到30℃）多可以保存2個(gè)月,。

2．4 引物退火溫度

引物的另一個(gè)重要參數(shù)是熔解溫度（Tm）,。這是當(dāng)50％的引物和互補(bǔ)序列表現(xiàn)為雙鏈DNA分子時(shí)的溫度。Tm對(duì)于設(shè)定PCR退火溫度是必需的,。在理想狀態(tài)下,，退火溫度足夠低，以保證引物同目的序列有效退火,，同時(shí)還要足夠高,，以減少非特異性結(jié)合。合理的退火溫度從55℃到70℃,。退火溫度一般設(shè)定比引物的Tm低5℃,。

根據(jù)所使用的公式及引物序列的不同，Tm會(huì)差異很大,。因?yàn)榇蟛糠止教峁┮粋€(gè)估算的Tm值,，所有退火溫度只是一個(gè)起始點(diǎn)?？梢酝ㄟ^(guò)分析幾個(gè)逐步提高退火溫度的反應(yīng)以提高特異性,。開(kāi)始低于估算的Tm 5℃，以2℃為增量,，逐步提高退火溫度,。較高的退火溫度會(huì)減少引物二聚體和非特異性產(chǎn)物的形成,。為獲得佳結(jié)果，兩個(gè)引物應(yīng)具有近似的Tm值,。引物對(duì)的Tm差異如果超過(guò)5℃,，就會(huì)由于在循環(huán)中使用較低的退火溫度而表現(xiàn)出明顯的錯(cuò)誤起始。如果兩個(gè)引物Tm不同,，將退火溫度設(shè)定為比低的Tm低5℃,。或者為了提高特異性,，可以在根據(jù)較高Tm設(shè)計(jì)的退火溫度先進(jìn)行5個(gè)循環(huán),，然后再根據(jù)較低Tm設(shè)計(jì)的退火溫度進(jìn)行剩余的循環(huán)。這使得在較為嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臈l件下可以獲得目的模板的部分拷貝,。