ProAqa親和色譜柱是設(shè)計用于HPLC和FPLC系統(tǒng)的高流速高壓色譜柱。其固定相采用平均粒徑為20 µm的多孔聚乙烯二乙烯基苯（PS/DVB）為基質(zhì),，表面鍵合一層親水涂層,，涂層上以化學(xué)鍵合的方式連接了蛋白質(zhì)A，蛋白質(zhì)A可結(jié)合除IgG3之外的含F(xiàn)c片段的免疫球蛋白,。該色譜柱可用于抗體和融合蛋白（可特異性結(jié)合重組蛋白A）的定量和小規(guī)模純化,。

Figure 1.抗體樣品在ProAqa 2.1×30 mm柱上的穿透曲線(Mab 321 from Sepax Technologies, Inc.) 。流動相：磷酸鈉緩沖溶液,，0.1M, pH 7.4, NaCl, 0.15M, 0.15mg/mL Mab 321,；流速：2.0 mL/min；檢測波長：280nm

技術(shù)參數(shù)

空白運行

    必須使用高純度的緩沖鹽,，并在使用前過濾(0.22 or 0.45 μm)所有的緩沖溶液,。

    上樣前，必須執(zhí)行空白運行,，并監(jiān)測本底,。為了減小結(jié)合和洗脫緩沖溶液之間變化產(chǎn)生的基線變化,，建議使用：     
(a) 50 mM磷酸鹽 pH 7, 0.15 M NaCl 作為起始/淋洗緩沖溶液,，以及 
(b) 0.1% (12 mM) HCl 0.15 M NaCl 作為洗脫緩沖液。

    以上是zui有效的淋洗/洗脫系統(tǒng),，產(chǎn)生的基線波動zui小,。如果要求洗脫樣品保留生物活性，不建議使用鹽酸(HCl),，因為鹽酸會使抗體變性,。

樣品的準(zhǔn)備和上樣

    為了確保樣品的有效結(jié)合和避免色譜柱篩板被污染，一般按照以下方式來準(zhǔn)備樣品：
(a) 將樣品溶解到或溶劑替換為起始/淋洗緩沖液,，這對于大體積樣品尤為重要(超過25%的柱體積),。
(b) 進(jìn)樣前離心或過濾樣品 (0.22 或0.45 μm)。
(c) 對血清樣品進(jìn)行熱處理（置于56 °C 下30分鐘）以去除會堵塞色譜柱的纖維蛋白原,。
(d) 對樣品進(jìn)行去脂處理,，因為脂類會對色譜柱產(chǎn)生不可逆的污染。
(e) 所有樣品使用前應(yīng)該用0.45 μm或0.2 μm濾膜過濾,。

    為了確保樣品的有效結(jié)合和避免填料與色譜柱被污染,，需要對樣品載量進(jìn)行測定： 
(a) ProAqa 動態(tài)結(jié)合載量見“描述”。
(b) 其它抗體的結(jié)合載量取決于抗體來源與所屬子類以及所使用的配體,。但是一般會低于“描述”中IgG的載量,。
(c) 當(dāng)作為分析用途時，可通過標(biāo)準(zhǔn)線性曲線測定zui小和zui大上樣量,。

起始/淋洗緩沖液

(a) 絕大多數(shù)情況下,，使用簡單的緩沖鹽如10 ~ 50 mM 磷酸鹽或Tris。
(b) 起始/淋洗緩沖液的pH范圍可在6.0到9.0之間,，但需注意當(dāng)pHzui高的時候結(jié)合力zui強,。
(c) 加入一些鹽 (0.1到0.2 M 的NaCl或KCl) 以防止因蛋白/蛋白相互作用引起的非特異性吸附。

洗脫條件

    如果色譜柱作為分析用途,，洗脫緩沖液為含25-100 mM 磷酸鹽,，pH為 2.0-3.5，含0-150 mM氯化鈉的溶液,。其它可能會用到的洗脫緩沖鹽組分包括鹽酸,、甘氨酸、檸檬酸,、乙酸或其它可調(diào)低pH的組分,。

    如果色譜柱作為制備用途，可采用以下條件。 
(a) 對于絕大多數(shù)抗體的洗脫,，可將pH降至2-3,，常用緩沖體系包括磷酸鹽、乙酸鹽,、鹽酸和甘氨酸,。根據(jù)緩沖體系的不同，緩沖鹽濃度為6-100 mM或2-20% (v/v),。
(b) 可用含0.15 M NaCl的6-12 mM HCl來獲得理想的pH范圍,，并將基線波動降到zui低程度。 
(c) 由于抗體會因其種類和所屬子類的不同而表現(xiàn)出不同的結(jié)合/洗脫行為,，*的洗脫條件需要通過經(jīng)驗性地測定,。

例1 單克隆抗體在ProAqa色譜柱上的洗脫