1.PCR技術(shù)基本原理
　　PCR技術(shù)的基本原理　類似于DNA的天然復(fù)制過程,，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物,。PCR由變性--退火--延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時(shí)間后,，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離,，使之成為單鏈,，以便它與引物結(jié)合,，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備,；②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右,，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對結(jié)合,；③引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料,，靶序列為模板,，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過程,，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈",，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需2～4分鐘,，2～3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基蚶┰齜糯蠹赴僂蟣?。滇u鍥教ㄆ?Plateau)所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。
　　PCR的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)　 PCR的三個(gè)反應(yīng)步驟反復(fù)進(jìn)行,，使DNA擴(kuò)增量呈指數(shù)上升,。反應(yīng)最終的DNA 擴(kuò)增量可用Y＝(1＋X)n計(jì)算。Y代表DNA片段擴(kuò)增后的拷貝數(shù),，X表示平(Y)均每次的擴(kuò)增效率,，n代表循環(huán)次數(shù)。平均擴(kuò)增效率的理論值為100%,，但在實(shí)際反應(yīng)中平均效率達(dá)不到理論值,。反應(yīng)初期，靶序列DNA片段的增加呈指數(shù)形式,，隨著PCR產(chǎn)物的逐漸積累,，被擴(kuò)增的DNA片段不再呈指數(shù)增加，而進(jìn)入線性增長期或靜止期,，即出現(xiàn)“停滯效應(yīng)",，這種效應(yīng)稱平臺(tái)期數(shù)、PCR擴(kuò)增效率及DNA聚合酶PCR的種類和活性及非特異性產(chǎn)物的竟?fàn)幍纫蛩?。大多?shù)情況下，平臺(tái)期的到來是不可避免的,。
　　PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 　可分為長產(chǎn)物片段和短產(chǎn)物片段兩部分,。短產(chǎn)物片段的長度嚴(yán)格地限定在兩個(gè)引物鏈5’端之間，是需要擴(kuò)增的特定片段,。短產(chǎn)物片段和長產(chǎn)物片段是由于引物所結(jié)合的模板不一樣而形成的,，以一個(gè)原始模板為例，在第一個(gè)反應(yīng)周期中,，以兩條互補(bǔ)的DNA為模板,，引物是從3’端開始延伸,，其5’端是固定的，3’端則沒有固定的止點(diǎn),，長短不一,，這就是“長產(chǎn)物片段"。進(jìn)入第二周期后,，引物除與原始模板結(jié)合外,，還要同新合成的鏈(即“長產(chǎn)物片段")結(jié)合。引物在與新鏈結(jié)合時(shí),，由于新鏈模板的5’端序列是固定的,，這就等于這次延伸的片段3’端被固定了止點(diǎn)，保證了新片段的起點(diǎn)和止點(diǎn)都限定于引物擴(kuò)增序列以內(nèi),、形成長短一致的“短產(chǎn)物片段",。不難看出“短產(chǎn)物片段"是按指數(shù)倍數(shù)增加，而“長產(chǎn)物片段"則以算術(shù)倍數(shù)增加,，幾乎可以忽略不計(jì),， 這使得PCR的反應(yīng)產(chǎn)物不需要再純化，就能保證足夠純DNA片段供分析與檢測用,。
　　
　　
　　 2.PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件
　　標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系：
　　　　　10×擴(kuò)增緩沖液 　 10ul
　　　　　4種dNTP混合物 　 各200umol/L
　　　　　引物 　　　　 　 各10～100pmol　
　　　　　模板DNA 　　　 　 0.1～2ug　
　　　 　 Taq DNA聚合酶 　 2.5u　
　　　　　Mg2+　　　　　　 1.5mmol/L
　　　　　加雙或三蒸水至 　 100ul
　　PCR反應(yīng)五要素： 參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即引物,、酶、dNTP,、模板和Mg2+
　　　　引物： 引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵,，PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度。理論上,，只要知道任何一段模板DNA序列,，就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴(kuò)增,。
　　設(shè)計(jì)引物應(yīng)遵循以下原則：
　　　?、僖镩L度： 15-30bp，常用為20bp左右,。
　　　?、谝飻U(kuò)增跨度： 以200-500bp為宜，特定條件下可擴(kuò)增長至10kb的片段,。
　　　?、垡飰A基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴(kuò)增效果不佳,，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶,。ATGC最好隨機(jī)分布，避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列,。
　　　?、鼙苊庖飪?nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu),，避免兩條引物間互補(bǔ)，特別是3’端的互補(bǔ),，否則會(huì)形成引物二聚體,，產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶。
　　　?、菀?’端的堿基,，特別是最末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對,，以避免因末端堿基不配對而導(dǎo)致PCR失敗,。
　　　　⑥引物中有或能加上合適的酶切位點(diǎn),，被擴(kuò)增的靶序列最好有適宜的酶切位點(diǎn),，這對酶切分析或分子克隆很有好處。
　　　?、咭锏奶禺愋裕阂飸?yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性,。