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注意事項(xiàng)
1,、電泳中使用的溴化乙錠(EB)為中度毒性,、強(qiáng)致癌性物質(zhì),務(wù)必小心,,勿沾染于衣物,、
皮膚、眼睛,、口鼻等,。所有操作均只能在專門電泳區(qū)域操作,戴一次性手套,,并及時更換,。
2、預(yù)先加入EB 時可能使 DNA 的運(yùn)動速度下降15%左右,,且不同構(gòu)型的 DNA 的影響程度不同,。所以為取得較真實(shí)的電泳結(jié)果可以在電泳結(jié)束后再用 0.5μg/ml 的 EB 溶液浸泡染色。EB在光照下易降解,,若凝膠放置一段時間后才觀察,,即使原來膠內(nèi)或樣品已加 EB,建議選擇EB溶液浸泡染色,。
3,、加樣進(jìn)膠時不要形成氣泡,需在凝膠液未凝固之前及時**,,否則,,需重新制膠。
4,、電泳時溴酚蘭在瓊脂糖凝膠中的運(yùn)動速度可以用于參考電泳速度,,已實(shí)際電泳條帶運(yùn)動速度為準(zhǔn),。
常見問題分析
常見問題 | 原因 | 對策 |
DNA條帶模糊 | DNA降解 | 實(shí)驗(yàn)過程避免核酸酶污染 |
電泳緩沖液陳舊 | 電泳緩沖液多次使用后,離子強(qiáng)度降低,,PH值上升,,緩沖能力減弱,從而影響電泳效果,。TBE建議使用10次就更換緩沖液 | |
所用電泳條件不合適 | 電泳時電壓不應(yīng)超過6V/CM,,溫度<30℃,巨大DNA鏈電泳,,溫度應(yīng)<15℃,,核查所用電泳緩沖液的緩沖能力,注意經(jīng)常更換 | |
DNA上樣量過多 | 減少凝膠中DNA上樣量 | |
DNA含鹽過高 | 電泳前通過乙醇沉淀去除多余鹽分 | |
有蛋白污染 | 電泳前酚抽提去除蛋白 | |
DNA變性 | 電泳前勿加熱,,用TE緩沖液稀釋DNA | |
出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶 | PCR擴(kuò)增有時出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶,。其原因往往PCR體系需要優(yōu)化,PCR程序需要摸索,。 | 其對策有:調(diào)整PCR體系和PCR程序,,摸索出合適的條件。 |
不規(guī)則DNA帶遷移 | 電泳條件不合適 | 電泳時電壓不應(yīng)超過6V/CM,,溫度<30℃,,巨大DNA鏈電泳,溫度應(yīng)<15℃,,核查所用電泳緩沖液的緩沖能力,,注意經(jīng)常更換 |
DNA變性 | 電泳前勿加熱,用TE緩沖液稀釋DNA | |
帶弱或無DNA帶 | DNA上樣量不夠 | 增加DNA上樣量,,聚丙烯酰胺凝膠電泳比瓊脂糖電泳靈敏度高,,上樣量可適當(dāng)降低 |
DNA降解 | 實(shí)驗(yàn)過程避免核酸酶污染 | |
DNA跑出凝膠 | 縮短電泳時間,降低電壓,,增強(qiáng)凝膠濃度 | |
EB染色的DNA,,所用光源不合適 | 應(yīng)用短波長(254nm)的紫外光源 | |
DNA帶缺失 | DNA跑出凝膠 | 縮短電泳時間,降低電壓,,增強(qiáng)凝膠濃度 |
分子大小相近的DNA帶不易分辨 | 增加電泳時間,,核準(zhǔn)正確凝膠濃度 | |
DNA變性 | 電泳前勿加熱,用20mM Nacl 緩沖液稀釋DNA | |
DNA鏈巨大,,常規(guī)凝膠電泳不合適 | 在脈沖凝膠電泳上分析 | |
電泳時Ladder扭曲 | 配膠的緩沖液和電泳緩沖液不是同時配置 | 同時配置,,電泳緩沖液高出液面1-2mm即可 |
電泳時電壓過高 | 電泳時電壓不應(yīng)超過6V/CM |
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