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線粒體蘋果酸脫氫酶(MDHm)測試盒測定意義：

MDH (EC 1.1.1.37)廣泛存在于動物,、植物、微生物和培養(yǎng)細胞中,，線粒體中MDH是TCA循環(huán)的關(guān)鍵酶之一,，催化蘋果酸形成草酰乙酸；相反,，胞漿中MDH催化草酰乙酸形成蘋果酸,。草酰乙酸是重要的中間產(chǎn)物， 連接多條重要的代謝途徑,。因此,，MDH在細胞多種生理活動中扮演著重要的角色，包括線粒體的能量代謝,、 蘋果酸-天冬氨酸穿梭系統(tǒng),、活性氧代謝和抗病性等。根據(jù)不同的輔酶特異性,，MDH分為NAD-依賴的MDH和NADP-依賴的MDH,，細菌中通常只含有NAD-MDH，在真核細胞中，NAD-MDH分布于細胞質(zhì)和線粒體中,。

測定原理：

MDHm催化NADH還原草酰乙酸生成蘋果酸，導(dǎo)致340nm處光吸收下降,。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計/酶標(biāo)儀,、臺式離心機、水浴鍋,、可調(diào)式移液器,、微量石英比色皿/96孔板和蒸餾水。
試劑組成和配制：

試劑一：液體×1瓶,，4℃保存,。

試劑二：液體×1瓶，4℃保存,。

試劑三：粉劑×1瓶（棕色）,，4℃避光保存。臨用前加入667μL無水乙醇,，蓋緊后充分混勻,，再加入9.333 mL蒸餾水混勻，避光保存,。

試劑四：粉劑×1管,，4℃避光保存。臨用前加1 mL蒸餾水,，充分溶解,。

標(biāo)準(zhǔn)品：粉劑×1瓶，臨用前加10 mL蒸餾水,，充分溶解,。1μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)液，4℃避光保存,。

測定操作：

1. 分光光度計/酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min,，調(diào)節(jié)波長到570 nm，蒸餾水調(diào)零,。

2. 空白管：取EP管,，加入10μL蒸餾水，100μL試劑二,，100μL試劑三和10μL試劑四,，混勻后蓋緊瓶蓋（防止水分散失），置于沸水浴中保溫15 min,，冷卻后反復(fù)顛倒EP管數(shù)次,，于570nm測定吸光值，記為A空白管。顯色后務(wù)必在30min內(nèi)測完,。

3. 標(biāo)準(zhǔn)管：取EP管,，加入10μL標(biāo)準(zhǔn)品，100μL試劑二,，100μL試劑三和10μL試劑四,，混勻后蓋緊瓶蓋（防止水分散失），置于沸水浴中保溫15 min,，冷卻后反復(fù)顛倒EP管數(shù)次,，于570nm測定吸光值，記為A標(biāo)準(zhǔn)管,。顯色后務(wù)必在30min內(nèi)測完,。

4. 測定管：取EP管，加入10μL上清液,，100μL試劑二,，100μL試劑三和10μL試劑四，混勻后蓋緊瓶蓋（防止水分散失）,，置于沸水浴中保溫15 min,，冷卻后反復(fù)顛倒EP管數(shù)次，于570nm測定吸光值,，記為A測定管,。顯色后務(wù)必在30min內(nèi)測完。

注意：空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只需要測定一次,。

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