本產(chǎn)品僅用于科研,，不用于臨床

氯霉素檢測試劑盒使用說明書（酶聯(lián)免疫法）

 1 原理及用途
本試劑盒采用間接競爭ELISA方法檢測水產(chǎn)組織、畜禽組織,、肝臟,、蛋類、蜂蜜,、牛奶及飼料等樣本中的氯霉素藥物（Chloramphenicol,，CAP），試劑盒由預(yù)包被偶聯(lián)抗原的酶標(biāo)板,、辣根酶標(biāo)記物,、抗體、標(biāo)準(zhǔn)品及其他配套試劑組成,。檢測時,，加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣本溶液，樣本中的氯霉素藥物和酶標(biāo)板上預(yù)包被偶聯(lián)抗原競爭抗氯霉素藥物抗體,，加入酶標(biāo)記物后,，用TMB底物顯色，樣本吸光度值與其所含氯霉素藥物含量成負(fù)相關(guān),，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣本中氯霉素藥物的殘留量,。
2 氯霉素檢測試劑盒技術(shù)指標(biāo)
2.1 試劑盒靈敏度：0.05ppb(ng/ml)
2.2 反應(yīng)模式：25℃，30min～30min～15min
2.3 檢測下限：
組織,、肝臟,、蜂蜜、牛奶……………0.025ppb
蛋類……………………………………0.1ppb
尿液、血清,、腸衣,、飼料、奶粉……0.05ppb
2.4 交叉反應(yīng)率：
氯霉素 …………………………………100%
甲砜霉素,、氟甲砜霉素………………＜0.1%
 2.5 樣本回收率：
組織,、肝臟……………………………85%±20%
蜂蜜、腸衣……………………………85%±25%
牛奶,、飼料……………………………75%±25%
尿液,、血清……………………………70%±20%
3 試劑盒組成
酶標(biāo)板……………………………96孔
標(biāo)準(zhǔn)液：各1ml
0ppb、0.05ppb,、0.15ppb,、0.45ppb、1.35ppb,、4.05ppb
高標(biāo)準(zhǔn)液（紅蓋）：100ppb………1ml
酶標(biāo)記物（紅蓋）…………………11ml
抗體工作液（藍(lán)蓋）………………5.5ml
底物液A（白蓋）……………………6ml
底物液B（黑蓋）……………………6ml
終止液（黃蓋）………………………6ml
20X濃縮洗滌液（白蓋）……………40ml
2X復(fù)溶液（黃蓋）…………………50ml
說明書………………………………1份
4 需要的器材和試劑
4.1 儀器：酶標(biāo)儀,、打印機(jī)、均質(zhì)器 ,、氮?dú)獯蹈裳b置,、振蕩器、離心機(jī),、刻度移液管,、天平（感量0.01g）
4.2 微量移液器：單道20µl-200µl，100µl-1000µl,、多道300µl
4.3 試劑：乙酸乙酯,、正己烷、乙腈,、醋酸鈉,、醋酸
、亞硝基鐵氰鉀（K2Fe(CN)5(NO)?2H2O）,、葡萄糖苷酸酶,、硫酸鋅（ZnSO4·7H2O）
5 樣本前處理
5.1 樣本處理前須知：
實(shí)驗(yàn)器具必須潔凈并使用一次性吸頭，以避免污染干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果,。
5.2 配液：
配液1：0.36M亞硝基鐵氰鉀溶液（牛奶,、奶粉樣本）
11.9g亞硝基鐵氰鉀加去離子水至100ml溶解。
配液2：1.04M硫酸鋅溶液（牛奶,、奶粉樣本）
    29.8g硫酸鋅加去離子水至100ml溶解,。
配液3：0.1M pH4.8醋酸鈉緩沖液（尿液樣本）
    2.4g醋酸鈉加去離子水500ml溶解，加1.2ml醋酸混勻,。
配液4：乙腈-水溶液
    V乙腈:V水=84:16
配液5：復(fù)溶液
    將2×復(fù)溶液用去離子水2倍稀釋,，用于樣本的復(fù)溶，復(fù)溶液在4℃環(huán)境可保存一個月。
5.3 樣本前處理步驟：
5.3.1 組織,、魚,、蝦、肝臟樣本處理方法 
1）稱取均質(zhì)后的樣本3±0.05g于50ml離心管中,，先加入3ml去離子水振蕩混勻，再加入6ml乙酸乙酯振蕩2分鐘,，室溫4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘,；
2）取上層液體2ml在50-60℃下氮?dú)獯蹈桑?br />3）用1ml正己烷溶解干燥的殘?jiān)偌尤?.5ml復(fù)溶液,，混合30秒,，室溫4000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘；
4）去除上層有機(jī)相,，取下層水相50μl進(jìn)行分析,。
    樣本稀釋倍數(shù)：0.5    檢測下限：0.025ppb
5.3.2 血清、血漿樣本處理方法
1）取1ml血清或血漿至離心管中,，加入2ml乙酸乙酯振蕩1分鐘,，室溫4000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，或靜置使水相與有機(jī)相分離,；
2）取全部上層液體在50-60℃下氮?dú)獯蹈桑?br />3）用1ml正己烷溶解干燥的殘?jiān)?，再加?ml復(fù)溶液，混合30秒,，室溫4000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘,；
4）去除上層有機(jī)相，取下層水相50μl進(jìn)行分析,。
    樣本稀釋倍數(shù)：1    檢測下限：0.05ppb
5.3.3 尿液樣本處理方法
1）取2ml尿液至離心管中,，加入0.1M pH4.8醋酸鈉緩沖液0.5ml混合，加40ul葡萄糖苷酸酶,，混勻,，37℃水解2小時以上；
2）將上述溶液恢復(fù)至室溫后加入8ml乙酸乙酯振蕩1分鐘,，室溫4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘,，取4ml上層液體在50-60℃下氮?dú)獯蹈桑?br />3）用1ml復(fù)溶液溶解干燥的殘?jiān)靹颍?br />4）取50μl進(jìn)行分析,。  
    樣本稀釋倍數(shù)：1    檢測下限：0.05ppb
5.3.4 蜂蜜樣本處理方法
1）取2±0.05g蜂蜜于離心管中,，用4ml去離子水溶解，加入4ml乙酸乙酯振蕩2分鐘,，室溫4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘；
2）取上層液體2ml在50-60℃下氮?dú)獯蹈桑?br />3）用0.5ml復(fù)溶液溶解干燥的殘?jiān)?，混勻?br />4）取50μl進(jìn)行分析。
樣本稀釋倍數(shù)：0.5    檢測下限：0.025ppb
（檢測下限0.025ppb，定量下限0.1ppb，因某些樣本有干擾建議以0.1ppb作為陽性判定值）
5.3.5 腸衣樣本處理方法
1）腸衣經(jīng)清洗后均質(zhì),，稱取均質(zhì)后的樣本1±0.05g于50ml離心管中，加入10ml乙酸乙酯振蕩2分鐘，室溫4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘,；
2）取上層液體5ml在50-60℃下氮?dú)獯蹈桑?br />3）用1ml正己烷溶解干燥的殘?jiān)偌尤?.5ml復(fù)溶液,，混合30秒,，室溫4000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘；
4）去除上層有機(jī)相,，取下層水相50μl進(jìn)行分析,。
    樣本稀釋倍數(shù)：1    檢測下限：0.05ppb
5.3.6 牛奶樣本處理方法
1）將牛奶樣本15℃4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，去除上層脂肪,，取5ml去脂肪奶樣于50ml離心管中,，加250ul 亞硝基鐵氰鉀溶液（配液1）振蕩混合30秒，加250ul 硫酸鋅溶液（配液2）振蕩混合30秒,，15℃4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘,；
2）取上層液體2.2ml（相當(dāng)于2ml鮮奶）于另一離心管中，加入4ml乙酸乙酯振蕩2分鐘,，室溫4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘,；
3）取上層液體2ml在50-60℃下氮?dú)獯蹈桑?br />4）用0.5ml復(fù)溶液溶解干燥的殘?jiān)靹颍?br />5）取50μl進(jìn)行分析,。
樣本稀釋倍數(shù)：0.5    檢測下限：0.025ppb
（檢測下限0.025ppb,，定量下限0.05ppb，因某些樣本有干擾建議以0.15ppb作為陽性判定值）
5.3.7 奶粉樣本處理方法
1）取2±0.05g奶粉于50ml離心管中,，用10ml去離子水溶解,，加入1ml 亞硝基鐵氰鉀溶液（配液1）和1ml 硫酸鋅溶液（配液2）振蕩混合，15℃4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘,；
2）取上層液體3.6ml（相當(dāng)于0.6g奶粉）于另一離心管中,，加入6ml乙酸乙酯振蕩5分鐘，室溫4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘,；
3）取上層液體4ml在50-60℃下氮?dú)獯蹈桑?br />4）用0.4ml復(fù)溶液溶解干燥的殘?jiān)?，混勻?br />5）取50μl進(jìn)行分析。
樣本稀釋倍數(shù)：1    檢測下限：0.05ppb
（檢測下限0.05ppb,，定量下限0.15ppb,，因某些樣本有干擾建議以0.15ppb作為陽性判定值）
 5.3.8 蛋類樣本處理方法
1）取3±0.05g均質(zhì)的蛋類樣本于50ml離心管中，加9ml乙腈-水溶液振蕩混合2分鐘,，15℃4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘,；
2）取上層液體3ml于另一離心管中,，加入3ml去離子水，再加4.5ml乙酸乙酯振蕩1分鐘,，15℃4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘,；
3）取全部上層液體在50-60℃下氮?dú)獯蹈桑?br />4）用1ml正己烷溶解干燥的殘?jiān)偌尤?ml復(fù)溶液,，混合30秒,，室溫4000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘；
4）去除上層有機(jī)相,，取下層水相50μl進(jìn)行分析,。
樣本稀釋倍數(shù)：2    檢測下限：0.1ppb
（檢測下限0.1ppb，定量下限0.3ppb）
5.3.9 飼料樣本處理方法
1）取2±0.05g均質(zhì)的飼料于50ml離心管中,，用2ml去離子水溶解,，再加入6ml乙酸乙酯振蕩2分鐘,，15℃4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘,；
2）取上層液體3ml載50-60℃下氮?dú)獯蹈桑?br />3）用1ml正己烷溶解干燥的殘?jiān)偌尤?ml復(fù)溶液,，混合30秒,，室溫4000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘；
4）去除上層有機(jī)相,，取下層水相50μl進(jìn)行分析,。
    樣本稀釋倍數(shù)：1    檢測下限：0.05ppb
6 酶聯(lián)免疫試驗(yàn)步驟
    將所需試劑從4℃冷藏環(huán)境中取出，置于室溫平衡30min以上, 洗滌液冷藏時可能會有結(jié)晶需恢復(fù)到室溫以充分溶解,，每種液體試劑使用前均須搖勻,。取出需要數(shù)量的微孔板及框架，將不用的微孔板放入自封袋,，保存于2-8℃,。
實(shí)驗(yàn)開始前，用去離子水將20×濃縮洗滌液按20倍稀釋成工作洗滌液,。
6.1 編    號：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號,，每個樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置,。
6.2 加樣反應(yīng)：加標(biāo)準(zhǔn)品或樣本50µl/孔到各自的微孔中,，然后加抗體工作液50µl/孔，輕輕振蕩5秒混勻,，25℃避光反應(yīng)30分鐘,。
6.3 洗    滌：將孔內(nèi)液體甩干，用工作洗滌液250µl/孔充分洗滌5次,，每次間隔30秒,，zui后用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）,。
6.4 加酶反應(yīng)：加酶標(biāo)記物100µl/孔，25℃避光反應(yīng)30分鐘,。
6.5 洗    滌：同上
6.6 顯    色：加底物液A 50µl/孔,，再加底物液B 50µl/孔，輕輕振蕩5秒混勻,，25℃避光顯色15分鐘,。
6.7 終    止：每孔加入終止液50µl，輕輕振蕩混勻,，終止反應(yīng),。
6.8 測吸光值：用酶標(biāo)儀于450nm處測定每孔吸光度值（建議用雙波長450/630nm）。測定應(yīng)在終止反應(yīng)后10分鐘內(nèi)完成,。
7 結(jié)果分析
7.1 百分吸光率的計(jì)算
    標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以*個標(biāo)準(zhǔn)液（0ppb）的吸光度值,，再乘以100%，即
 百分吸光度值（%）＝
A
×100%
A0
A—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值
A0—0ppb標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值
7.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計(jì)算
    以標(biāo)準(zhǔn)液百分吸光率為縱坐標(biāo),，對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)液濃度（ppb）的對數(shù)為橫坐標(biāo),，繪制標(biāo)準(zhǔn)液的半對數(shù)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中,，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度,，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中待測物的實(shí)際濃度。
    若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計(jì)算,，更便于大量樣本的準(zhǔn)確,、快速分析。（索?。?br />8 注意事項(xiàng)
8.1 室溫低于25℃或試劑及樣本沒有回到室溫（25℃）會導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低,。
8.2 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性,，重復(fù)性不好的現(xiàn)象,。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。
8.3 混合要均勻,，洗板要*,，在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的*性,。
8.4 在所有孵育過程中,，用蓋板膜封住微孔板，避免光線照射,。
8.5 不要使用過了有效期的試劑盒,，不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑。
8.6 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì),，應(yīng)當(dāng)棄之,。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值小于0.5個單位（A450nm< 0.5 ）時,，表示試劑可能變質(zhì)。
8.7 反應(yīng)終止液有腐蝕性,，避免接觸皮膚,。
9 貯藏及保存期
儲藏條件：試劑盒于2-8℃保存，避免冷凍,。
保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為1年,，生產(chǎn)日期見包裝盒。