本產(chǎn)品僅用于科研,，不用于臨床

孔雀石綠檢測試劑盒使用說明書（酶聯(lián)免疫法）

1 原理及用途
本試劑盒采用間接競爭ELISA方法，同時把隱性孔雀石綠氧化成孔雀石綠,，可檢測動物組織和水樣中的孔雀石綠（Malachite Green,，MG）總量。試劑盒由預(yù)包被偶聯(lián)抗原的酶標(biāo)板,、辣根酶標(biāo)記物,、抗體、標(biāo)準(zhǔn)品及其他配套試劑組成,。檢測時,，加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品溶液，樣本中的孔雀石綠和酶標(biāo)板上預(yù)包被偶聯(lián)抗原競爭抗孔雀石綠抗體,，加入酶標(biāo)記物后，用TMB底物顯色,，樣本吸光度值與其所含孔雀石綠含量成負(fù)相關(guān),，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣本中孔雀石綠的殘留量。
2 孔雀石綠檢測試劑盒技術(shù)指標(biāo)
2.1 試劑盒靈敏度：0.05ppb(ng/ml)
2.2 反應(yīng)模式：37℃，10min～30min～30min～15min
2.3 檢測下限：
魚/蝦等水產(chǎn)品 ……………0.5ppb
水樣 …………………………0.1ppb
2.4 交叉反應(yīng)率：
顯性孔雀石綠………………………100%
結(jié)晶紫………………………………91%
隱性孔雀石綠（氧化后）…………100%
隱性結(jié)晶紫（氧化后）……………91%
 2.5 樣本回收率：
魚/蝦等水產(chǎn)品,、水樣……………90%±10%
3 試劑盒組成
3 試劑盒組成
酶標(biāo)板………………………………96孔
10×標(biāo)準(zhǔn)品(棕色蓋)：各0.5ml
0ppb,、0.5ppb、1ppb,、2ppb,、4ppb、8ppb
標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液(藍(lán)蓋)………………10ml
10×濃縮酶結(jié)合物…………………1.6ml
10×濃縮抗體……………………0.8ml
底物液A(白蓋)………………………7ml
底物液B(黑蓋)………………………7ml
終止液(黃蓋)………………………7ml
10X濃縮洗滌液(白蓋)……………50ml
樣本稀釋緩沖液(紅蓋）………………5ml
氧化劑(黑蓋)…………………………3ml
說明書 ………………………………1份
4 需要的器材和試劑
4.1 儀器：酶標(biāo)儀,、打印機,、均質(zhì)器 、氮氣吹干裝置,、振蕩器,、離心機、刻度移液管,、天平（感量0.01g）,、恒溫箱
4.2 微量移液器：單道20µl-200µl、100µl-1000µl,、多道300µl
4.3 試劑：乙腈,、乙酸、二氯甲烷,、無水硫酸鈉,、中性氧化鋁、正己烷
5 樣本前處理
5.1 樣本處理前須知：
實驗器具必須潔凈并使用一次性吸頭,，以避免污染干擾實驗結(jié)果,。
5.2 配液：
配液1：樣本提取液
    首先將乙腈與二氯甲烷配成體積比為2:1混合液，然后向上述混合液中加入乙酸,，使其終濃度約為1%,，按需配制。（例：100ml 乙腈+50ml 二氯甲烷+1.5ml 乙酸,。）
5.3 樣本前處理步驟：
5.3.1 低脂肪含量樣品（羅非魚,、鯽魚、鰱魚,、鳙魚,、草魚、蝦,、鯉魚等）
1）魚蝦去皮取肉,，用勻漿器均質(zhì)樣品；
2）稱取2g均質(zhì)好的樣品,，放入50ml離心管中,，加入10ml樣本提取液(配液1),，立即搖勻，加入1g無水硫酸鈉,，充分震蕩10min,，4000r/min 離心5 min；
3）取7ml上清移至50ml離心管中,，加入20ul氧化劑,，震蕩2min，加入7ml 正己烷,，顛倒混勻1min,，4000r/min離心5min。
4）取下層5ml,，50-60℃下氮氣吹干,。加入300ul 乙腈，渦旋使殘渣溶解（注意蓋緊蓋防止乙腈揮發(fā)掉）,。
5）測定時取上述乙腈溶解液25ul,，加50ul樣本稀釋緩沖液，175μl 蒸餾水,，混合均勻,，取50ul分析。
    樣本稀釋倍數(shù)：3     檢測下限：0.5ppb
5.3.2 高脂肪含量樣品（鰻魚,、鯰魚等）
1）魚蝦去皮取肉,，用勻漿器均質(zhì)樣品；
2）稱取2g均質(zhì)好的樣品,，放入50ml離心管中,，加入10ml樣本提取液(配液1)，立即搖勻,，再加入1g中性氧化鋁,、1g無水硫酸鈉，充分震蕩5min,，4000r/min 離心5 min,；
3）取7ml上清移至50ml離心管中，加入20ul氧化劑,，震蕩2min,，加入7ml 正己烷，顛倒混勻1min,，4000r/min離心5 min,。
4）棄去全部上層正己烷層（注：中間蛋白脂肪層需棄除），再加入7ml 正己烷,，顛倒混勻1min,，4000r/min 離心5min,； 
5）取下層5ml,，50-60℃下氮氣吹干,，加入300ul 乙腈，渦旋使殘渣溶解（注意蓋緊蓋防止乙腈揮發(fā)掉）,。
6）測定時取上述乙腈溶解液25ul,，加50ul樣本稀釋緩沖液，175ul 蒸餾水,，混合均勻,，加入500ul正己烷渦旋2min，棄去全部上層正己烷,，取下層50ul分析,。
    樣本稀釋倍數(shù)：3     檢測下限：0.5ppb
5.3.2水質(zhì)樣品
取水樣175ul, 加入50ul 樣本稀釋緩沖液, 25ul 乙腈，取50ul分析,。 
樣本稀釋倍數(shù)：1.43    檢測下限：0.1ppb
注：此方法所得到的結(jié)果為孔雀石綠,；隱性孔雀石綠；結(jié)晶紫,；隱性結(jié)晶紫的總量,。
6 酶聯(lián)免疫試驗步驟
    將所需試劑從4℃冷藏環(huán)境中取出，置于室溫平衡30min以上, 洗滌液冷藏時可能會有結(jié)晶需恢復(fù)到室溫以充分溶解,，每種液體試劑使用前均須搖勻,。取出需要數(shù)量的微孔板及框架，將不用的微孔板放入自封袋,，保存于2-8℃,。
實驗開始前需：
配液A：洗滌工作液
將50ml 10×濃縮洗滌液用去離子水按1:9稀釋成500ml工作洗滌液備用。
配液B：活化劑工作液
將氧化劑按1:99體積進(jìn)行稀釋（現(xiàn)用現(xiàn)配,，按需配制）
配液C：抗體工作液
用配液A（洗滌工作液）將10×濃縮抗體10倍稀釋（臨時用時,，按需配制）
配液D：酶標(biāo)記物
用配液A（洗滌工作液）將10×濃縮酶結(jié)合物10倍稀釋（臨時用時，按需配制）
制備孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)液：
標(biāo)準(zhǔn)品溶液（0ppb,，0.05ppb,，0.1ppb，0.2ppb,，0.4ppb,，0.8ppb）
取6個1.5ml離心管，把標(biāo)準(zhǔn)品濃縮液用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液稀釋10倍（如：450ul標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液加入50ul 10×標(biāo)準(zhǔn)品濃縮液）
6.1 編    號：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號,，每個樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行,，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。
6.2 活化：加120ul活化劑工作液（配液B）到微孔中,，室溫下反應(yīng)10min,，倒掉拍干,，加洗滌工作液（配液A）250ul/孔，洗滌5次,，每次間隔30s,，棄去孔中液體，在吸水紙上拍干（拍干后未被清除的氣泡可用未使用過的吸頭戳破）,。
6.3 加樣反應(yīng)：加標(biāo)準(zhǔn)品或樣本50µl/孔到各自的微孔中,，然后加抗體工作液50µl/孔，輕輕振蕩5秒混勻,，37℃避光反應(yīng)30分鐘,。
6.4 洗    滌：將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌液工作液250µl/孔充分洗滌5次,，每次間隔30秒,，zui后用吸水紙拍干。
6.5 加酶反應(yīng)：加酶標(biāo)記物100µl/孔,，37℃避光反應(yīng)30分鐘,。
6.6洗    滌：同上
6.7 顯    色：加底物液A 50µl/孔，再加底物液B 50µl/孔,，輕輕振蕩5秒混勻,，37℃避光顯色15分鐘。
6.8 終    止：每孔加入終止液50µl,，輕輕振蕩混勻,，終止反應(yīng)。
6.9 測吸光值：用酶標(biāo)儀于450nm處測定每孔吸光度值（建議用雙波長450/630nm）,。測定應(yīng)在終止反應(yīng)后10分鐘內(nèi)完成,。
7 結(jié)果分析
7.1 百分吸光率的計算
    標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以*個標(biāo)準(zhǔn)液（0ppb）的吸光度值，再乘以100%,，即
 百分吸光度值（%）＝
A
×100%
A0
A—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值
A0—0ppb標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值
7.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計算
    以標(biāo)準(zhǔn)液百分吸光率為縱坐標(biāo),，對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)液濃度（ppb）的對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)液的半對數(shù)曲線圖,。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中,，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中待測物的實際濃度,。
    若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計算,，更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析,。（索?。?br />8 注意事項
8.1 室溫低于25℃或試劑及樣本沒有回到室溫（25℃）會導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。
8.2 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性,，重復(fù)性不好的現(xiàn)象,。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。
8.3 混合要均勻,，洗板要*,，在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的*性,。
8.4 在所有孵育過程中,，用蓋板膜封住微孔板，避免光線照射,。
8.5 不要使用過了有效期的試劑盒，不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑,。
8.6 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì),，應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值小于0.5個單位（A450nm< 0.5 ）時,，表示試劑可能變質(zhì),。
8.7 反應(yīng)終止液有腐蝕性，避免接觸皮膚,。
9 貯藏及保存期
儲藏條件：試劑盒于2-8℃保存,，避免冷凍。
保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為1年,，生產(chǎn)日期見包裝盒,。