酶聯(lián)免疫法（ELISA）測(cè)定氯霉素CAP殘留

（1）試劑和材料 以下所有試劑除特別注明外,，均為分析純?cè)噭?；水為符合GB／T
6682規(guī)定的二級(jí)水。
①0．2mol／L硫酸
②卜葡糖苷酸酶
③乙酸乙酯
④異辛烷
⑤三氯甲烷酶聯(lián)免疫法（ELISA）測(cè)定氯霉素CAP殘留
⑥乙酸鈉
⑦氯霉素檢測(cè)試劑盒（2—8~C冰箱中保存）
（2）儀器和設(shè)備
①酶聯(lián)免疫反應(yīng)讀數(shù)儀
②分析天平 精度0．00001g
③天平 精度0．01g
④冷凍離心機(jī)
⑤50ml具塞離心管
⑥勻漿機(jī)酶聯(lián)免疫法（ELISA）測(cè)定氯霉素CAP殘留
⑦微型振蕩器
⑧回旋振蕩器
⑨微量移液器
⑩恒溫干燥箱
（3）測(cè)定步驟
①尿樣的制備 取上層用稀釋劑／洗滌緩沖劑稀釋5倍,，備片
②肌肉組織（包括魚和蝦）中氯霉素的提取 取38組織,，加入6mi的乙酸乙酯，勻漿lmin,，在2000r／mln下,，離心15min。取上層4mi,，在70~C下蒸干,。加入2mi的異辛烷：三氯甲烷（2：3）溶解剩余物，旋轉(zhuǎn)lmin,。加Rmi稀釋劑／洗滌緩沖劑,，再旋轉(zhuǎn)2rain。（如果有乳化現(xiàn)象,，把試管放在80~C的恒溫室約20min,，直至見到分離層）。再在2000r／min下離心10rain,，取上層備用。
③肝／腎中氯霉素的提取 取3s組織,，加入3ml乙酸鈉緩沖劑（o．1mol幾,，pH 5）和8000U 9—葡糖苷酸酶，勻漿30s,，置于37~C的恒溫箱內(nèi)2h,。加12ml的乙酸乙酯，勻漿lmin,，在2000r／Illin下,，離心15min。取上層lml,，在70~C下蒸干,。加入2ml的異辛烷：三氯甲烷（2：3）溶解剩余物，旋轉(zhuǎn)lmin,。加lml稀釋劑／洗滌緩沖劑,，再旋轉(zhuǎn)2min（如果有乳化現(xiàn)象，把試管放在80~C的恒溫室約20min,，直至見到分離層）,。再在2000r／mln下離心10rain,，取上層備用。
④測(cè)定,。
室溫應(yīng)控制在19—25~C,。
取在19～25 0C放置1—2h的試劑盒，按每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液和試樣溶液至少兩孔計(jì)算所需酶聯(lián)板條的數(shù)量,，插入框架,。每個(gè)微孔加入標(biāo)準(zhǔn)溶液或試樣溶液各25tzL，再在每個(gè)微孔內(nèi)加入酶標(biāo)二抗100t~L,，封口膜封板,，室溫下孵育1h。
倒出孔內(nèi)液體,，將酶聯(lián)板倒置在吸水紙上拍打,，使孔內(nèi)沒有殘余液體。加入250／uL稀釋的稀釋劑／洗滌緩沖劑到酶聯(lián)板的微孔內(nèi),，稍后倒出孔內(nèi)液體,，再將酶聯(lián)板倒置在吸水紙上拍打，如此重復(fù)操作洗板6次,。
用多道移液器加入底物125tzI,。到每個(gè)微IL內(nèi)，室溫避光孵育20min,。
用多道移液器每孔加終止液o．2mol／L硫酸100ul,。
在10min內(nèi)將酶聯(lián)板放于酶標(biāo)儀內(nèi)，于450nm波長處測(cè)定吸光度值,。
（4）計(jì)算 用數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析,，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，并得出試料中氯霉素的含量,。
（5）靈敏度和回收率 本方法的檢測(cè)限為：尿樣0,，25P8／L，肌肉0．1P8／k8
1．5ug／kg,。
本方法在lug／kg添加濃度水平上,，回收率范圍為60％～120％。