本試劑盒僅供研究使用                                       

ELISA法定量測定人血清,、血漿,、痰液、細(xì)胞培養(yǎng)物上清或其它相關(guān)液體中TNF-α含量,。

腫瘤壞死因子（tumornecrosisfactor,，TNF）是一種具有多種生物活性的細(xì)胞因子。人TNF-α基因編碼前體蛋白,，其信號肽將前體蛋白固定在細(xì)胞膜上,，成為具有活性的跨膜干擾素（TNF），分子質(zhì)量為26×10³,，經(jīng)酶切去除信號肽生成分泌型TNF-α,，分子質(zhì)量為17×10³。TNF-α細(xì)胞來源廣泛,，包括各種免疫細(xì)胞,、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞,、表皮細(xì)胞,、角質(zhì)細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞,、星形細(xì)胞,、成骨細(xì)胞等,。

   TNF-α具有廣泛的生物學(xué)活性，如：參與炎性反應(yīng)和免疫應(yīng)答,，抗腫瘤,，參與內(nèi)毒素性休克等病理過程，引起惡病質(zhì)等,。其具有雙重作用,，,一方面在機體免疫調(diào)節(jié)，機體生理功能和抗感染等方面發(fā)揮重要作用,，另一方面若持續(xù)釋放或產(chǎn)生過多則會引起發(fā)熱!、休克,、惡病質(zhì)等,，同時TNF-α可進一步誘導(dǎo)IL-6、IL-8,、IL-10等細(xì)胞因子的產(chǎn)生,，這些促炎性細(xì)胞因子參與體內(nèi)急性反應(yīng)、發(fā)熱反應(yīng),、引起趨化肽釋放等,，還可使內(nèi)皮細(xì)胞活化而導(dǎo)致血管通透性增加。

本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心酶標(biāo)免疫分析法測定標(biāo)本中TNF-α水平,。用純化的抗體包被微孔板,，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入TNF-α抗原,、生物素化的抗大鼠TNF-α抗體,、HRP標(biāo)記的親和素，經(jīng)過*洗滌后用底物TMB顯色,。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的。顏色的深淺和樣品中的TNF-α呈正相關(guān),。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值）,，計算樣品濃度。

1.         酶聯(lián)板：一塊（96孔）

2.         標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）：2瓶,，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml,，蓋好后靜置10分鐘以上，然后反復(fù)顛倒/搓動以助溶解,，其濃度為10 ng/mL,，做系列倍比稀釋后，分別稀釋成10 ng/mL,，5 ng/mL ,，2.5 ng/mL,，1.25 ng/mL，0.62 ng/mL,，0.31 ng/mL,，0.16 ng/mL，其原液直接作為zui高標(biāo)準(zhǔn)濃度,，樣品稀釋液直接作為標(biāo)準(zhǔn)濃度0 ng/mL,，臨用前15分鐘內(nèi)配制。

3.         樣品稀釋液：1×20ml/瓶,。

4.         檢測稀釋液A：1×10ml/瓶,。

5.         檢測稀釋液B：1×10ml/瓶。

6.         檢測溶液A：1×120ul/瓶（1：100）臨用前以檢測稀釋液A1：100稀釋,。稀釋前根據(jù)預(yù)先計算好的每次實驗所需的總量配制（每孔100ul）,，實際配制時應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如1ul檢測溶液A加99ul檢測稀釋液A的比例配制,，輕輕混勻,，在使用前一小時內(nèi)配制。

7.         檢測溶液B：1×120ul/瓶（1：100）臨用前以檢測稀釋液B1：100稀釋,。稀釋方法同檢測溶液A,。

8.         底物溶液：1×10ml/瓶。

9.         濃洗滌液：1×30ml/瓶,，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍,。

10.     終止液：1×10ml/瓶（2N H₂SO4）。

1．細(xì)胞培養(yǎng)物上清：請離心后收集上清,，并將標(biāo)本保存于-20℃,，且應(yīng)避免反復(fù)凍融。

2．血清：標(biāo)本請于室溫放置2小時或4℃過夜后于1000 x g離心20分鐘,，取上清即可檢測,，或?qū)?biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。

3．血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑,，標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘，或?qū)?biāo)本放于-20℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。

4. 痰液處理：選擇痰液中較為粘稠部分稱重, 加兩倍于痰量的011%DTT（二硫蘇糖醇）37℃恒溫水浴振蕩5min,再加入兩倍于痰量的PBS緩沖液繼續(xù)振蕩15~20min,150目的金屬絲網(wǎng)過濾,1500r/min離心10min吸取上清液-20℃冷凍保存,。

各試劑在使用前平衡至室溫。

1.         加樣：分別設(shè)空白孔,、標(biāo)準(zhǔn)孔,、待測樣品孔,。除空白孔外，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)溶液或待測樣品100ul,，注意不要有氣泡,，輕輕混勻，酶標(biāo)板加上蓋,，37℃反應(yīng)120分鐘,。

2.         棄去液體，甩干,，不用洗滌,。

3.         每孔加檢測溶液A工作液 100ul，37℃,60分鐘,。洗板3次,，350ul/每孔，甩干,。

4.         每孔加檢測溶液B工作液 100ul,，37℃,，60分鐘,，洗板5次，甩干,。

5.         依序每孔加底物溶液90ul,，37℃避光顯色30分鐘（此時肉眼可見標(biāo)準(zhǔn)品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色，后3-4孔梯度不明顯）,。

6.         依序每孔加終止溶液50ul,，終止反應(yīng)（此時蘭色立轉(zhuǎn)）。用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）,。

注：

1． 每次實驗留一孔作為空白調(diào)零孔,，該孔不加任何試劑，只是zui后加底物溶液及2NH₂SO4,。測量時先用此孔調(diào)OD值至零,。

2．為防止樣品蒸發(fā)，試驗時將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi),。

洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體,；在實驗臺上鋪墊幾層

吸水紙，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次,；將推薦的洗滌緩沖液至少0.4ml注入孔內(nèi),，浸泡1-2分鐘，根據(jù)需要,，重復(fù)此過程數(shù)次,。
    自動洗板：如果有自動洗板機,，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實驗過程中。

    本試劑盒可同時檢測重組或天然的人TNF-α,，且與其它相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng),。

  以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)（對數(shù)坐標(biāo)），OD值為縱坐標(biāo)（普通坐標(biāo)）,，在半對數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線,，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù),；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式,，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度,，再乘以稀釋倍數(shù),，即為樣品的實際濃度。

1． 洗滌過程非常重要,，不充分的洗滌易造成假陽性,。

2． 一次加樣時間控制在5分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多,，推薦使用排槍加樣,。

3． 請每次測定的同時做標(biāo)準(zhǔn)曲線，做復(fù)孔,。

4． 如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高,，請先稀釋后再測定，計算時請zui后乘以稀釋倍數(shù),。

5．在配制標(biāo)準(zhǔn)品,、檢測溶液工作液時，請以相應(yīng)的稀釋液配制,，不能混淆,。

6．底物請避光保存。

0.15 ng/mL -10 ng/mL

1．試劑盒保存：-20℃（較長時間不用時）,；2-8℃（頻繁使用時）,。

2．有效期：6個月

3．濃洗滌液會有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶,。

4．中,、英文說明書可能會有不一致之處，請以英文說明書為準(zhǔn),。

5．剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會含有少許水樣物質(zhì),，此為正常現(xiàn)象，不會對實驗結(jié)果造成任何影響,。