成功植入胰腺干細(xì)胞的步驟     

1,、細(xì)胞的制備；細(xì)胞的來源：采用流產(chǎn)人胚胎（5-7月胎齡）胰腺組織,，于解剖顯微鏡下去除周圍的脂肪和結(jié)締組織,。輕輕地分離并切碎胰腺,，膠原酶370C震胰蕩消化30分鐘，然后加冷牛血清和Hanks液保護(hù)細(xì)胞并終止消化,。此方法不但可以分離外分泌腺,，還可以降低免疫原性從而減少免疫排斥反應(yīng)。1500轉(zhuǎn)離心10分后棄上清,，用生長液保存具有生理功能的細(xì)胞備用,，達(dá)到細(xì)胞量再行植入。

　　 2,、胰腺干細(xì)胞的制備：由于胚胎數(shù)量不足,，往往不能滿足胰島細(xì)胞種植的需要，就須在體外進(jìn)行擴(kuò)增,，達(dá)到種植的細(xì)胞量,。方法同胰島細(xì)胞的制備，在細(xì)胞終止消化后靜置10分,，棄上清,，0。25%胰蛋白酶370C消化至細(xì)胞懸液,，在無糖DMEM培養(yǎng)基（含非必需氨基酸,，B27）中培養(yǎng)。兩天后換液加入終濃度為10µg/ml的KGF,，1mg/ml的ITS,。以后每三天換液一次并改換培養(yǎng)基的成分為葡萄糖濃度為17。8mmol/L,，10mmol/L尼可酰氨,，2%胎牛血清（誘導(dǎo)）其他營養(yǎng)成分不變，觀察其生長情況并在其6-7天時進(jìn)行傳代（擴(kuò)增）,。

　　 3,、細(xì)胞植入：當(dāng)胰島細(xì)胞和胰腺干細(xì)胞的數(shù)量達(dá)到糖尿病人種植時，先進(jìn)行細(xì)胞的生理功能鑒定及病毒和細(xì)菌培養(yǎng),，排除病毒和污染后再行移植,。

　　 ㈠、細(xì)胞數(shù)量是影響種植成功的關(guān)鍵因素,，因此每個人種植的數(shù)量是不同的,，嚴(yán)格按每公斤體重6000個胰島當(dāng)量以上進(jìn)行植入。

　　 ㈡,、細(xì)胞的純度,，即將培養(yǎng)好的胰腺細(xì)胞采用雙硫腙染色以平板計數(shù)法結(jié)合EIN法對胰島陽性細(xì)胞計數(shù)，通常細(xì)胞純度在80%左右。

　　 ㈢,、細(xì)胞活性鑒定：采用吖啶橙和碘丙啶對細(xì)胞進(jìn)行染色,，吖啶橙染色后在熒光顯微鏡下活細(xì)胞呈綠色熒光，死亡的細(xì)胞碘丙啶染色結(jié)合后發(fā)出紅色熒光,。細(xì)胞染色后活度要達(dá)到90%以上。

　　 4,、降低免疫原性：防止免疫排斥反應(yīng)是植入細(xì)胞成功的關(guān)鍵之一,，當(dāng)細(xì)胞在制備中370C消化30分鐘，即可降低其免疫原性,；應(yīng)用免疫抑制劑對防止植入細(xì)胞后的急性排斥反應(yīng)很重要,，成人植入后，聯(lián)合應(yīng)用免疫抑制劑包括環(huán)孢素A,、硫唑嘌呤,、霉酚酸脂、他克莫司等,。約服用一個月的免疫抑制劑無免疫排斥反應(yīng)即可停用,。5-20歲處在生長發(fā)育期慎用或不用，或改用不影響發(fā)育的免疫排斥劑,。