聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction,，PCR）簡稱PCR技術(shù),，是近年來發(fā)展起來的一種體外擴增特異DNA片段的技術(shù),，由于其可使特定DNA片段在數(shù)量上呈指數(shù)增加至可檢測范圍,，故成為基因診斷的重要方法,。在PCR基礎(chǔ)上衍生的一些擴增技術(shù)已用于基因突變的診斷,。目前單基因疾病PGD所用的方法主要是基于PCR技術(shù)通過檢測單細胞靶基因的數(shù)目及結(jié)構(gòu)有無異常加以診斷。

  （一）聚合酶鏈式反應(yīng)
  PCR實際上是在模板DNA,、引物和4種脫氧核糖核苷酸存在的條件下依賴于DNA聚合酶的酶促合成反應(yīng),。基本原理是：用一對寡核苷酸鏈做引物,，引導(dǎo)DNA聚合酶在引物識別位點之間兩條互補鏈上進行DNA合成,，經(jīng)過模板變性、退火及延伸三步為一個循環(huán),，每一循環(huán)的產(chǎn)物可以作為下一個循環(huán)的模板,，多次循環(huán)可使特定DNA片段在數(shù)量上呈指數(shù)增加至2×l0（6一7）拷貝。
    單細胞PCR無需抽提DNA,，經(jīng)過變性前處理步驟后,，即進行PCR循環(huán)反應(yīng)。與經(jīng)典PCR相比，其優(yōu)點是無需制備DNA,，節(jié)省時間,，從獲得樣本、PCR反應(yīng)到出結(jié)果只需幾個小時左右,。但由于單細胞PCR的模板量極低,，僅1–2拷貝，故PCR體系必須具備下列條件：①對模板擴增的忠實性好,；②方法穩(wěn)定,；③無非特異性擴增；④擴增的靈敏度高,。目前用于PGD的PCR方法主要有以下幾種：
    1．巢式PCR  由于單細胞中可檢測的僅l一2個拷貝的基因序列,。為了既不影響特異性又獲得較大的敏感性，巢式引物被應(yīng)用,。巢式PCR設(shè)置二步PCR,，只有初級PCR中特異的擴增片段才可能被二級引物擴增，可減少引物與模板非特異性位點的復(fù)性,、引物二聚體的形成以及非特異背景產(chǎn)物的產(chǎn)生,，從而提高了擴增特異性，而且增加了zui終產(chǎn)物量,。
    2．多重PCR  如果與疾病相關(guān)的基因十分龐大,，如杜氏肌營養(yǎng)不良癥（DMD），有2 OOO多kb長,。這些基因常多處發(fā)生缺失或突變,，而且這些改變發(fā)生在相鄰十至數(shù)百個kb的距離，超出了PCR技術(shù)所能擴增的有效長度,，對此,，可采用多重PCR，既在同一試管中加人多對引物,，擴增同一模板的幾個區(qū)域,。目前報道多重PCR反應(yīng)zui多可同時擴增12條區(qū)帶。
    3．熒光PCR  指熒光標(biāo)記的寡核苷酸引物,。PCR產(chǎn)物用激光分析系統(tǒng)進行分析,，從產(chǎn)物大小到核苷酸序列都能夠被準確分析。由于不同的熒光分子在激光激發(fā)下有不同波長,，在片段分析結(jié)構(gòu)系統(tǒng)中,，相同大小的不同產(chǎn)物可以被區(qū)分開。其敏感性優(yōu)于普通PCR千倍,。準確性可達l一2bp,。對于單細胞35–4O個循環(huán)就可以產(chǎn)生足夠量的產(chǎn)物,，不僅減少了散在的、非特異的污染,，而且縮短診斷時間?，F(xiàn)該方法已廣泛用于PGD。
    4．熒光定量PCR  該技術(shù)融匯了PCR和DNA探針雜交技術(shù)的優(yōu)點,，反應(yīng)體系中,，不僅有兩條普通的引物，還有一條熒光標(biāo)記探針,。這條探針的5’和3’端分別標(biāo)記了熒光報告基團（R）和熒光淬滅基團（Q）,。當(dāng)探針保持完整時，無熒光發(fā)出,。PCR開始后,，隨著鏈的延伸，Taq酶將熒光探針切斷,，釋放出熒光信號,，且信號的強弱與PCR的產(chǎn)物數(shù)量成正比,，檢測出前者可計算出后者,，從而獲取DNA模板的準確結(jié)果。該技術(shù)在*閉管的情況下進行,，無需凝膠電泳,，通過特殊探頭直接探測PCR過程中熒光信號的變化，解決了常規(guī)PCR不能定量及擴增產(chǎn)物污染而導(dǎo)致的假陽性,、操作復(fù)雜等問題,，減少污染的可能性，提高了診斷的效率,。
    5．原位PCR  此技術(shù)由HaSSe等于1990年建立,，即在固定于同一載玻片上的同一個單細胞上，先用PCR原位擴增,，再用FISt{檢測,，目前PGD中應(yīng)用該方法，PCR的有效率為65％,，F(xiàn)ISI–I達85％,。遺憾的是ADO較常規(guī)PCR高。但這種新方法有效的把原位雜交技術(shù)的細胞定位能力與PCR擴增的所有潛在敏感性結(jié)合起來,，相信隨著引物設(shè)計及熒光PCR與原位PCR有效的結(jié)合,，其不足會得到克服，該方法也許會成為PGD的未來,。

    6．免疫PCR  是PCR法與酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）法的融合技術(shù),，利用了PCR的大量擴增能力和抗原抗體反應(yīng)的特異性。其原理是將目的基因的擴增產(chǎn)物用生物素標(biāo)記，檢測突變的特異性探針用地高辛標(biāo)記,，二者經(jīng)變性退火處理后加到含抗生物素的酶標(biāo)板內(nèi),，通過顯色來鑒定突變是否存在。根據(jù)顯色深淺可做定量分析,。該法已用于囊性纖維病基因突變的檢測,。
    7．等位基因特異性擴增  在設(shè)計引物時，根據(jù)已知突變位點的特征,，在引物3’端或中間設(shè)計一錯配堿基,，使之僅能與突變型或野生型基因互補，而只擴增相對應(yīng)的突變型或野生型基因,。主要用于點突變導(dǎo)致的遺傳病的檢測,。其優(yōu)點是只需一步PCR，而無需電泳和標(biāo)記,，擺脫了分子生物學(xué)方法中必經(jīng)電泳的現(xiàn)象,。在相互競爭的突變型和野生型引物中，分別采用不同熒光染料標(biāo)記擴增的DNA,，可直接對擴增產(chǎn)物進行判讀,。另外使用具有特定酶切位點的內(nèi)嵌引物，也可提高產(chǎn)物特異性和產(chǎn)量,，DNA擴增后用酶切割,，由酶切產(chǎn)物可明確是否有基因突變，該法已應(yīng)用于單個精子的DNA分析,。