人抑制素B（INH-B）ELISA試劑盒僅供體外研究使用!
預(yù)期應(yīng)用
ELISA法定量測定人血清,、血漿或其它相關(guān)生物液體中INH-B含量。
 
實驗原理
用純化的INH-B抗體包被微孔板，制成固相載體,，往微孔中依次加入標(biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)品,、生物素化的INH-B抗體、HRP標(biāo)記的親和素,，經(jīng)過*洗滌后用底物（TMB）顯色,。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的,。顏色的深淺和樣品中的INH-B呈正相關(guān),。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（ OD值），計算樣品濃度,。
 
試劑盒組成及試劑配制
1,、 酶標(biāo)板：一塊（96孔）
2、 標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）： 2瓶,，請臨用前15分鐘內(nèi)配制,。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5 ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘,，同時反復(fù)顛倒/搓動以助溶解,，其濃度為1,000 pg/ml，然后做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進行倍比稀釋）,，分別配制成1,000 pg/ml,，500 pg/ml，250 pg/ml,，125 pg/ml,，62.5 pg/ml，31.2 pg/ml,，15.6 pg/ml,，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 pg/ml。如配制500 pg/ml標(biāo)準(zhǔn)品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）1,000 pg/ml的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中,，混勻即可,，其余濃度以此類推。
3,、 樣品稀釋液：1×20ml,。
4、 檢測稀釋液A：1×10ml,。
5,、 檢測稀釋液B：1×10ml。
6,、 檢測溶液A：1×120 /瓶（1:100）,。臨用前以檢測稀釋液A 1:100稀釋（如：10 檢測
溶液A / 990 檢測稀釋液A）,，充分混勻，稀釋前根據(jù)預(yù)先計算好的每次實驗所需的總量
配制（100 /孔）,，實際配制時應(yīng)多配制  0.1-0.2ml,。
7、 檢測溶液B：1×120 /瓶（1:100）,。臨用前以檢測稀釋液B 1:100稀釋,。稀釋方法同檢
測溶液A。
8,、 底物溶液：1×10ml/瓶,。
9、 濃洗滌液：1×30ml/瓶,，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍,。
10、終止液：1×10ml/瓶（2 mol/L H2SO4）,。
11,、覆膜：5張
12、使用說明書：1份
 
 
 
自備物品
1,、 酶標(biāo)儀（建議儀器使用前提前預(yù)熱）
2,、 微量加液器及吸頭，EP管
3,、 蒸餾水或去離子水,，濾紙
 
標(biāo)本的采集及保存
1、 血清：全血標(biāo)本請于室溫放置2小時或4 過夜后于1000 g離心20分鐘,，取上清即可
檢測,，或?qū)⑸锨逯糜?20 或-80 保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。
2,、 血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于 1000 g離心15分鐘,，
取上清即可檢測,，或?qū)⑸锨逯糜?20 或-80 保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。
3、 其它生物標(biāo)本：請1000 g離心20分鐘,，取上清即可檢測,，或?qū)⑸锨逯糜?20 或-80 保
    存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。
注：以上標(biāo)本均應(yīng)密封保存,，4 保存應(yīng)小于1周，-20 不應(yīng)超過1個月，-80 不應(yīng)超過2個月,；標(biāo)本溶血會影響zui后檢測結(jié)果,，因此溶血標(biāo)本不宜進行此項檢測。
 
操作步驟
實驗開始前,，各試劑均應(yīng)平衡至室溫（試劑不能直接在37 溶解）,；試劑或樣品配制時，
均需充分混勻,，混勻時盡量避免起泡,。實驗前應(yīng)預(yù)測樣品含量，如樣品濃度過高時,，應(yīng)對樣品進行稀釋,，以使稀釋后的樣品符合試劑盒的檢測范圍，計算時再乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù),。
1,、 加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔,、待測樣品孔,。空白孔加樣品稀釋液 100 ,，余孔分別加
標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品100 ,，注意不要有氣泡，加樣時將樣品加于酶標(biāo)板底部,，盡量不觸及
孔壁,，輕輕晃動混勻，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜,，37 溫育2小時,。為保證實驗結(jié)果有效
性，每次實驗請使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液,。
2,、 棄去液體，甩干,，不用洗滌,。每孔加檢測溶液A工作液 100 （臨用前配制），酶標(biāo)板加
    上覆膜,，37 溫育1小時,。
3、 棄去孔內(nèi)液體,，甩干,，洗板 3次,，每次浸泡1-2分鐘，大約400 /每孔,，甩干（也可輕
    拍將孔內(nèi)液體拍干）,。
4、 每孔加檢測溶液B工作液（臨用前配制） 100 ,，加上覆膜,，37 溫育1小時。
5,、 棄去孔內(nèi)液體,，甩干，洗板5次,，方法同步驟3,。
6、 每孔加底物溶液90 ,，酶標(biāo)板加上覆膜37 避光顯色（反應(yīng)時間控制在15-30分鐘,，當(dāng)
    標(biāo)準(zhǔn)孔的前3-4孔有明顯的梯度藍(lán)色，后3-4孔梯度不明顯時,，即可終止）,。
7、 每孔加終止溶液50 ,，終止反應(yīng),，此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物
    液的加入順序相同,。
8,、 立即用酶標(biāo)儀在450nm波長測量各孔的光密度（OD值）。
 
注：
1,、 試劑準(zhǔn)備：所有試劑在使用前應(yīng)平衡至室溫,，使用后請立即按照說明書要求保存試劑。
實驗操作中請使用一次性的吸頭,，避免交叉污染,。
2、 加樣：加樣或加試劑時,，*個孔與zui后一個孔加樣之間的時間間隔如果太大,，將會導(dǎo)致不
同的 “預(yù)溫育”時間，從而明顯地影響到測量值的準(zhǔn)確性及重復(fù)性,。一次加樣時間（包括標(biāo)準(zhǔn)
品及所有樣品）控制在10分鐘內(nèi),。推薦設(shè)置復(fù)孔進行實驗。
3,、 溫育：為防止樣品蒸發(fā),，實驗時將加上蓋或覆膜的酶標(biāo)板置于濕盒內(nèi)，以避免液體蒸發(fā),；
洗板后應(yīng)盡快進行下步操作,，任何時侯都應(yīng)避免酶標(biāo)板處于干燥狀態(tài)；同時應(yīng)嚴(yán)格遵守給
定的溫育時間和溫度,。
4,、 洗滌：洗滌過程中反應(yīng)孔中殘留的洗滌液應(yīng)在濾紙上拍干，勿將濾紙直接放入反應(yīng)孔中
吸水,，同時要消除板底殘留的液體和手指印,，避免影響zui后的酶標(biāo)儀讀數(shù)。
 
5,、 試劑配制：Detection A及Detection B在使用前請手甩幾下或少時離心處理,，以使管壁
或瓶蓋的液體沉積到管底。標(biāo)準(zhǔn)品,、檢測溶液A工作液,、檢測溶液B工作液請依據(jù)所需
的量配制使用，并使用相應(yīng)的稀釋液配制,，不能混淆,。請配制標(biāo)準(zhǔn)品及工作液，盡
量不要微量配制（如吸取檢測溶液A時,，一次不要小于10 ）,，以避免由于不準(zhǔn)確稀釋
而造成的濃度誤差；請勿重復(fù)使用已稀釋過的標(biāo)準(zhǔn)品,、檢測溶液A工作液或檢測溶液B
工作液,。
6、 反應(yīng)時間的控制：加入底物后請定時觀察反應(yīng)孔的顏色變化（比如,，每隔10分鐘）,，如
顏色較深，請?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應(yīng),，避免反應(yīng)過強從而影響酶標(biāo)儀光密度讀數(shù),。
7、 底物：底物請避光保存,，在儲存和溫育時避免強光直接照射,。
    
洗板方法
1、 手工洗板方法：將推薦的洗滌緩沖液至少0.4ml注入孔內(nèi),，浸泡1-2分鐘,，吸去（不可
觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體，在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙,，酶標(biāo)板朝下用力拍幾
次,；根據(jù)需要,，重復(fù)此過程數(shù)次。
2,、 自動洗板：如果有自動洗板機,，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實驗過程中。
 
特異性
    本試劑盒可同時檢測重組或天然的人INH-B,，且與其它相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng),。
 
計算
  各標(biāo)準(zhǔn)品O.D.值扣除空白孔O.D.值后作圖（七點圖），如設(shè)置復(fù)孔,，則應(yīng)取其平均值計算,。以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為縱坐標(biāo)（對數(shù)坐標(biāo)）， O.D.值為橫坐標(biāo)（對數(shù)坐標(biāo)）,，在對數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線,。推薦使用專業(yè)制作曲線軟件進行分析，如 curve expert 1.3,，根據(jù)樣品的O.D.值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度,，再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與 OD值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程式,，將樣品的O.D.值代入方程式,，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù),，即為樣品的實際濃度,。
 
檢測范圍：15.6 pg/ml - 1,000 pg/ml，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線請取用以下濃度值：1,000 pg/ml,，500 pg/ml,，250 pg/ml，125 pg/ml,，62.5 pg/ml,，31.2 pg/ml，15.6 pg/ml,。
 
zui低檢測限：3.9 pg/ml
 
說明
1,、 在儲存及溫育過程中避免將試劑暴露在強光中。所有試劑瓶蓋須蓋緊以防止蒸發(fā)和微生物的
污染,，因為蛋白水解酶的干擾將導(dǎo)致出現(xiàn)錯誤的結(jié)果,。
2、 試劑盒保存：請收到試劑盒后盡快將標(biāo)準(zhǔn)品,、檢測溶液A和檢測溶液B保存于-20 ,，其余試
劑短期保存請置于4 ，長期保存則置于-20 。開封后的酶標(biāo)板要密封加干燥劑后保存于
-20 ,，避免潮濕,。
3、 濃洗滌液會有鹽析出,，稀釋時可在水浴中加溫助溶,。
4、 剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會有少許水樣物質(zhì),，此為正常現(xiàn)象,，不會對實驗結(jié)果造成任何影響,。
5、 有效期：6個月,。