在一定培養(yǎng)條件下能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需氧和兼性厭氧革蘭氏陰性無芽孢桿菌,。大腸菌群不是細(xì)菌學(xué)上分類命名,，它不代表某一種或某一屬的細(xì)菌，而是一組與糞便污染有關(guān)的細(xì)菌,。這群細(xì)菌包括：埃希氏菌屬,、檸檬酸桿菌屬、產(chǎn)氣克雷伯氏菌屬,、腸桿菌屬（又叫產(chǎn)氣桿菌屬,，包括陰溝腸桿菌和產(chǎn)氣腸桿菌）和等。

衛(wèi)生學(xué)意義：

大腸菌群作為糞便污染的指標(biāo)菌評(píng)價(jià)樣品中是否受到糞便的污染,。表示了對(duì)人體健康是否具有潛在的危險(xiǎn)性,。直接反映了樣品受糞便污染的程度,。

GB4789.3-2016 大腸菌群MPN法

什么是MPN法?

MPN法是統(tǒng)計(jì)學(xué)和微生物學(xué)結(jié)合的一種定量檢測法。待測樣品經(jīng)系列稀釋并培養(yǎng)后,，根據(jù)其未生長的zui低稀釋度與生長的最高稀釋度,，應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)概率論推算出待測樣品中大腸菌群的最大可能數(shù)。

MPN值并不能表示實(shí)際菌落數(shù),，實(shí)際菌落數(shù)有可能落在置信區(qū)間內(nèi)的任何一點(diǎn),，MPN值是落在這個(gè)置信區(qū)間內(nèi)概率最大的一點(diǎn)。

靈敏度較高,，適用于污染菌落較少的樣品,。

大腸菌群MPN計(jì)數(shù)的檢驗(yàn)操作

操作注意事項(xiàng)

建議用磷酸鹽緩沖液作為稀釋液，因?yàn)榱姿猁}緩沖液能更好地糾正食品樣品中pH變化,，對(duì)細(xì)菌具有保護(hù)作用,。

初發(fā)酵接種量超過1mL，則用雙料LST肉湯,。

培養(yǎng)基檢查,。加入樣品前應(yīng)觀察導(dǎo)管內(nèi)是否有氣泡，若有,，應(yīng)適當(dāng)傾斜試管,，讓氣體排出。

結(jié)果觀察,。某些食品樣品可能會(huì)堵塞小導(dǎo)管底部,，影響導(dǎo)管內(nèi)氣泡的觀察，可將試管微微傾斜,，用手指輕彈管壁,，觀察是否有一串小氣泡沿管壁升起,，若有，則判定產(chǎn)氣。

培養(yǎng)基原理解析

月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯(LST)：

? 月桂基硫酸鹽能抑制革蘭氏陽性菌生長,，胰蛋白胨提供碳源和氮源滿足細(xì)菌生長的需求,；氯化鈉可維持均衡的滲透壓,；乳糖是大腸菌群可發(fā)酵的糖類；磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀是緩沖劑,。

? 36±1℃培養(yǎng)24h后若已產(chǎn)氣,，則可停止培養(yǎng),。如果沒有觀察到有產(chǎn)氣的現(xiàn)象,，則繼續(xù)培養(yǎng)至48±2h,。

? 如接種量超過1mL，則用雙料LST肉湯,。

煌綠乳糖膽鹽肉湯(BGLB)：

? 膽鹽與煌綠均能抑制革蘭氏陽性菌生長,。

? 培養(yǎng)基配方當(dāng)中含有膽鹽,，大腸菌群發(fā)酵乳糖所產(chǎn)的酸會(huì)與膽鹽發(fā)生反應(yīng),，形成膽酸沉淀。培養(yǎng)基可由原來的綠色變?yōu)辄S色,。

大腸菌群最大可能數(shù)(MPN)報(bào)告

確證的大腸菌群BGLB陽性管數(shù),，檢索MPN表,，報(bào)告每1g(mL)樣品中大腸菌群的MPN值

當(dāng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果在MPN表中無法查找到MPN值時(shí)，如：陽性管數(shù)為122,，123,，232,，233等時(shí)，建議增加稀釋度(可做4~5個(gè)稀釋度),，使樣品最高稀釋度能達(dá)到陰性終點(diǎn)(如果污染程度不能判定,，則多加一稀釋度),，然后再遵循相關(guān)的規(guī)則進(jìn)行查找,，最終確定MPN值。

表B.1

大腸菌群最可能數(shù)(MPN)檢索表

GB4789.3-2016大腸菌群計(jì)數(shù)平板法

大腸菌群平板計(jì)數(shù)法流程圖

操作注意事項(xiàng)

平板法相對(duì)MPN法來說，結(jié)果更加直觀精確,。長成的一個(gè)單菌落也可能來自樣品中的2~3或更多個(gè)細(xì)胞,。因此平板菌落計(jì)數(shù)的結(jié)果往往偏低。適用于污染較為嚴(yán)重的樣品,。

從一個(gè)樣品取樣到傾注瓊脂平板,，應(yīng)在15分鐘內(nèi)完成,。

檢驗(yàn)所用物品應(yīng)無菌，無抑菌殘留物,。

BGLB確證試驗(yàn)需從VRBA平板上挑起至少10個(gè)典型和可疑菌落進(jìn)行,，如平板上菌落數(shù)少于10個(gè)，則挑取全部典型和可疑菌落進(jìn)行確證,。

培養(yǎng)基原理解析

結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂(VRBA)：

? 配方中膽鹽和結(jié)晶紫抑制革蘭氏陽性菌,，中性紅作為指示劑，在酸性條件下為紫紅色,。

? 大腸菌群分解乳糖所產(chǎn)的酸與膽鹽結(jié)合,，可形成粉紅色菌落菌落周圍有膽酸鹽沉淀環(huán)。

? 該培養(yǎng)基無需高溫高壓滅菌,，現(xiàn)配現(xiàn)用,。

計(jì)數(shù)典型和可疑菌落數(shù)

大腸菌群定義：

選取菌落數(shù)在15CFU~150 CFU之間的平板，分別計(jì)數(shù)平板上出現(xiàn)的典型和可疑大腸菌群菌落,。典型菌落為紫紅色,，菌落周圍有紅色的膽鹽沉淀環(huán)，菌落直徑為0.5mm或更大,。

證實(shí)試驗(yàn)：

從各樣品中接種同一樣品濃度的VRBA平板上共挑取10個(gè)不同類型的典型和可疑菌落,，分別移種于BGLB肉湯管內(nèi)，36℃±1℃培養(yǎng)24h~48h,，觀察產(chǎn)氣情況,。凡BGLB肉湯管產(chǎn)氣，即可報(bào)告為大腸菌群陽性,。

大腸菌群平板計(jì)數(shù)的報(bào)告

經(jīng)最后證實(shí)為大腸菌群陽性的試管比例乘以計(jì)數(shù)的平板菌落數(shù),，再乘以稀釋倍數(shù)，即為每g(mL)樣品中大腸菌群數(shù),。例：10^-4樣品稀釋液1mL,，在VRBA平板上有100個(gè)典型和可疑菌落，挑取其中10個(gè)接種BGLB肉湯管,，證實(shí)有6個(gè)陽性管,，則該樣品的大腸菌群數(shù)為：

100×6/10×10⁴/g(mL)=6.0×10⁵CFU/g(mL)。

若所有稀釋度(包括液體樣品原液)平板均無菌落生長,，則以小于1乘以zui低稀釋倍數(shù)計(jì)算,。

質(zhì)量控制

實(shí)驗(yàn)室過程中，每批樣品稀釋液都要做空白對(duì)照,。

為了控制環(huán)境污染,，每次檢驗(yàn)過程中，于檢驗(yàn)臺(tái)上打開兩塊計(jì)數(shù)瓊脂平板,，并在檢驗(yàn)環(huán)境中暴露不少于15分鐘,，將此平板與本批次樣品同時(shí)進(jìn)行培養(yǎng)，以掌握檢驗(yàn)過程中是否存在來自檢驗(yàn)環(huán)境的污染,。

定期使用大腸埃希氏菌ATCC25922或相應(yīng)定量活菌參考品,，在P2實(shí)驗(yàn)室或陽性對(duì)照實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，用適當(dāng)?shù)氖称窐悠愤M(jìn)行陽性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,，并進(jìn)行記錄,，次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)至少每2個(gè)月進(jìn)行1次。

大腸菌群測試片法

原理

大腸菌群檢測片由輕便防水紙質(zhì)材料做支撐,，其上覆蓋干燥培養(yǎng)基層(營養(yǎng)物質(zhì),、凝固劑、選擇抑制劑,、顯色劑)和透明隔水膜組成,，經(jīng)輻照滅菌?？捎糜谑称?、飲料等的大腸菌群計(jì)數(shù)。含有四氮唑指示劑菌落為紅色,，發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸和產(chǎn)氣,。

培養(yǎng)基原理解析

菌落計(jì)數(shù)特別方便(容易判讀)，紅色菌落,，易于食品顆粒分開,，無菌落重疊現(xiàn)象；

菌落分布特別均勻,；

避免了培養(yǎng)基對(duì)細(xì)菌熱損傷有關(guān),；

菌落蔓延或半透明菌膜現(xiàn)象很少發(fā)生；

經(jīng)濟(jì)環(huán)保無粉塵,，體積小,，重量輕，易儲(chǔ)運(yùn),；

保質(zhì)期長干制無水培養(yǎng)基,，性質(zhì)穩(wěn)定，保質(zhì)期更長,。

使用說明