Annexin V-Alexa Fluor 647/PI 凋亡檢測試劑盒說明書

Annexin V-Alexa Fluor 647/PI Apoptosis Detection Kit 

貨號：K2577     

保存：2-8  ℃避光保存 

組分說明

Cat.No.                    K2577

KitSize                     50

4×BindingBuffer            10ml

PropidiumIodide,PI          500 μl

AnnexinV-AlexaFluor647    250 μl

產(chǎn)品簡介 

   AnnexinV-AlexaFluor647/PI凋亡檢測試劑盒是一種采用AnnexinV-AlexaFluor647與 PI 雙染法進行細胞早期凋亡分析的檢測試劑盒,。

   細胞凋亡早期改變發(fā)生在細胞膜表面,，這些細胞膜表面的改變之一是磷脂酰絲氨酸（PS）從細胞膜內(nèi)轉(zhuǎn)移到細胞膜外,，使PS 暴露在細胞膜外表面,。PS 是一種帶負電荷的磷脂,，正常主要存在于細胞膜的內(nèi)面,，在細胞發(fā)生凋亡時細胞膜上的這種磷脂分布的不對稱性被破壞而使PS暴露在細胞膜外,。Annexin V具有易于結(jié)合到磷脂類如 PS 的特性,，對PS 有高度的親和性。因此,，該蛋白可充當一敏感的探針檢測暴露在細胞膜表面的PS,。PS 轉(zhuǎn)移到細胞膜外不是凋亡所*的，也可發(fā)生在細胞壞死中,。兩種細胞死亡方式間的差別是在凋亡的初始階段細胞膜是完好的,，而細胞壞死在其早期階段細胞膜的完整性就被破壞。另外一種活細胞非透過性熒光染料碘化丙啶（PropidiumIodide,PI）不能通過完整的活細胞,，但能夠?qū)乃篮偷蛲鐾砥诘募毎M行染色,，因此通常將 AnnexinV 與PI 配合染色，以區(qū)別凋亡早期細胞與壞死細胞和凋亡的晚期細胞,。

注意事項 

1.  消化細胞時不能用含EDTA 的胰酶,。 

2.  本試劑盒需使用流式細胞儀進行檢測。

3.  需自備PBS 和去離子水,。

4.  熒光染料均存在淬滅問題,，保存和使用過程中請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅,。

5.  PI 對人體有刺激性,，請注意適當防護。

6.  請穿實驗服并戴一次性手套操作,。

操作步驟 

1. 細胞樣品的準備：

    a. 對于貼壁細胞：小心收集細胞培養(yǎng)液到一離心管內(nèi)備用,。用胰酶消化細胞，至細胞可以被輕輕用移液管或槍頭吹打下來時，加入前面收集的細胞培養(yǎng)液,，吹打下所有的貼壁細胞,，并輕輕吹散細胞。再次收集到離心管內(nèi),。1000×g 左右離心3-5 分鐘,，沉淀細胞。對于特定的細胞,，如果細胞沉淀不充分,，可以適當延長離心時間或稍稍加大離心力。小心吸除上清,，可以殘留約50 μl 左右的培養(yǎng)液,，以避免吸走細胞。加入約1 ml 4℃預(yù)冷的    PBS,，重懸細胞,，再次離心沉淀細胞，小心吸除上清,。再次加入1ml4℃預(yù)冷的 PBS,，重懸細胞，再次離心沉淀細胞,。

    b. 對于懸浮細胞：1000×g 左右離心3-5 分鐘,，沉淀細胞。對于特定的細胞,，如果細胞沉淀不充分,，可以適當延長離心時間或稍稍加大離心力。小心吸除上清,，可以殘留約                            50 微升左右的培養(yǎng)液,，以避免吸走細胞。加入約 1 ml 4℃預(yù)冷的PBS,，重懸細胞,，并轉(zhuǎn)移到1.5 毫升離心管內(nèi)。再次離心沉淀細胞,，小心吸除上清,，可以殘留約                                50μl 左右的   PBS，以避免吸走細胞,。再次加入1ml4℃預(yù)冷的PBS,，重懸細胞，再次離心沉淀細胞,。

2.  用去離子水按1:4 稀釋  BindingBuffer（4mlBindingBuffer+12ml 去離子水）,；

3.  用 250μlBindingBuffer 重新懸浮細胞,，調(diào)節(jié)其濃度為1×106/ml；

4.  取100μl 的細胞懸液于5ml 流式管中,，加入5μlAnnexinV/AlexaFluor647 和  10μl20μg/ml 的 PI 溶液,；

5.  混勻后于室溫避光孵育15 分鐘；

6.  在反應(yīng)管中加400μlPBS,，流式細胞儀（FACS）分析,。

    

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