炭疽桿菌(BA)核酸檢測試劑盒(熒光-PCR 法)

【產(chǎn)品名稱】 將步驟 1 提取的 DNA,、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取 4μL,，分別加入相應的反

通用名稱：炭疽桿菌(BA)核酸檢測試劑盒(熒光-PCR 法)

應管中,，蓋好管蓋,，混勻，短暫離心,。

Name ：Bacillus Anthracis Detection Kit (Real-Time PCR Method) 4 擴增（核酸擴增區(qū)）

【包裝規(guī)格】48T/盒

【預期用途】

炭疽是由炭疽桿菌（Bacillus Anthracis, BA）感染引起的一種人獸共患病,。BA 在環(huán)境中形成芽孢，可長期,、穩(wěn)定地存在于自然界中,。由于 BA 的穩(wěn)定性及其致病性，易引發(fā)突發(fā)公共衛(wèi)生事件,。目前的 BA 檢測方法主要基于病原體的培養(yǎng),、染色鏡檢、血清學檢測等,，但這些方法均不適合早期的快速偵檢,。基于核酸檢測的熒光-PCR技術(shù),，因其靈敏度高,、操作簡單、特異性好,，可快速檢測炭疽病原,，及時控制炭疽疫

4.1 將待檢測反應管置于熒光定量 PCR 儀反應槽內(nèi)；

4.2 設(shè)置好通道,、樣品信息,，反應體系設(shè)置為 25μL；

熒光通道選擇： 檢測通道（Reporter Dye）FAM,， 淬滅通道（Quencher Dye）

NONE,，ABI 系列儀器請勿選擇 ROX 參比熒光，選擇 None 即可,。

4.3 推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置：

[1] 本試劑盒適用于檢測皮膚水泡液,、咽拭子、可疑食物等樣本中的炭疽桿菌,，用于炭疽桿菌感染的輔助診斷,。

5 結(jié)果分析判定

【檢驗原理】

6.1 結(jié)果分析條件設(shè)定

本試劑對炭疽桿菌特異性基因設(shè)計引物和熒光探針[2-3]，用熒光 PCR 技術(shù)對炭疽 設(shè)置 Baseline 和 Threshold：一般直接按機器自動分析的結(jié)果分析,，當曲線出現(xiàn)桿菌的核酸進行體外擴增檢測,，用于臨床上對可疑感染者的病原學診斷。

【試劑組成】

整體傾斜時,，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范圍內(nèi)調(diào)節(jié)),、stop 值(一般可在 5~20 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))，以及 Threshold 的 Value 值(上下拖動閾值線至高于陰性對照),，重新分析結(jié)果,。

 名 稱                                                規(guī) 格   

 核酸提取液酶液                   1.5mL×2 管

唾液                               50μL×1 管

BA 反應液                          1.0mL×1 管        

BA 陽性質(zhì)控品                       50μL×1 管  

陰性質(zhì)控品                          250μL×1 管   

注：

7結(jié)果判斷

陽性：檢測通道 Ct 值≤35.0，丏曲線有明顯的指數(shù)增長曲線,。

可疑：檢測通道 Ct 值>35.0,，丏出現(xiàn)明顯擴增曲線的樣本建議重復試驗，重復試驗結(jié)果出現(xiàn) Ct 值≤35.0 和明顯擴增曲線者為陽性,，否則為陰性,。

陰性：樣本檢測結(jié)果無 Ct 值丏無明顯的擴增曲線。

8 檢測方法的局限性

1） 不同批號試劑不能混用,。 Ø 樣本檢測結(jié)果不樣本收集,、處理、運送以及保存質(zhì)量有關(guān),；

2） 試劑盒內(nèi)各試劑組份足夠包裝規(guī)格所標示的檢測次數(shù),。

【儲存條件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存,、運輸,、反復凍融數(shù)不超過 5 次，有效期 12 個月,。

【適用儀器】

ABI ,、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler,、Bio-Rad,、eppendorf 等系列

Ø  樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會出現(xiàn)假陽性結(jié)果,；

Ø  陽性對照,、擴增產(chǎn)物泄漏，會導致假陽性結(jié)果,；

Ø  病原體在流行過程中基因突變,、重組，會導致假陰性結(jié)果,；

Ø  不同的提取方法存在提取效率差異,，會導致假陰性結(jié)果；

Ø  試劑運輸,，保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降,，出現(xiàn)假陰性或定  量檢測不準確的結(jié)果；

 熒光定量 PCR 檢測儀,。 Ø 本檢測結(jié)果僅供參考,，如須確診請結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測手段。

【標本采集】

皮膚炭疽,，取水泡液 1mL,；肺炭疽,，采集咽拭子標本，放入標本采集管中,；腸炭疽,，取糞便 1g

【保存和運輸】

上述標本短期內(nèi)可保存于-20℃，長期保存可置-70℃,，但不能超過 6 個月,，標本運送應采用 2~8℃冰袋運輸，嚴禁反復凍融,。

【使用方法】

9. 質(zhì)控標準

陰性質(zhì)控品：無明顯擴增曲線或無 Ct 值顯示,；

陽性質(zhì)控品：擴增曲線有明顯指數(shù)生長期，丏 Ct 值≤32,；

以上條件應同時滿足,，否則實驗視為無效。

【注意事項】

Ø  所有操作嚴格按照說明書進行,；

Ø 試劑盒內(nèi)各種組分使用前應自然融化,，*混勻并短暫離心；

Ø  反應液應避光保存,；

 1. . 樣品處理（樣本處理區(qū)） Ø 反應中盡量避免氣泡存在,，管蓋需蓋緊；

 1.1 1 樣本前處理

固體樣本：手術(shù)剪剪碎混勻后取 0.5g 于研磨器中研磨,，加入 1.5mL 生理鹽水后繼續(xù)研磨,，待勻漿后轉(zhuǎn)至 1.5mL 滅菌離心管中，8000rpm 離心 2min,，取上清液 100μ

L 于 1.5mL 滅菌離心管中,；液體樣本：直接取 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中。

1 111 提取

1) 對上述處理好的標本加入 50μL 核酸提取液,，100℃恒溫處理 10min,，13,000rpm 離心 5min，取上清液轉(zhuǎn)移至新的 1.5mL EP 管,，-20℃保存,；

2) DNA 的提取也可以采用深圳綠食源生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的 DNA 提取試劑盒（離心柱提取法），請嚴格按照試劑盒說明書進行操作,。

 2. 試劑配制（試劑準備區(qū)）

根據(jù)待檢測樣本總數(shù),，設(shè)所需要的 PCR 反應管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對照+1 管陽性對照；樣品每滿 7 份,，多配制 1 份),，每測試反應體系配制如下表：

Ø 使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)與用工作服；

Ø 樣本處理,、試劑配制,、加樣需在不同區(qū)進行，以免交叉污染,；

Ø 實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器,；

Ø  試劑盒里所有物品應視為污染物對待，并按照《微生物生物醫(yī)學實驗室生物安全通  則》進行處理,。

 試劑                        BA 反應液           酶液

 用量（樣本數(shù)為 N）          20μL                       1μL

 將混合好的測試反應液分裝到 PCR 反應管中，21uL/管,。

3 加樣（樣本處理區(qū)）

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