尿嘧啶-N-糖基化酶（UNG酶）說(shuō)明書(shū)

Uracil-N-Glycosylase

Cat. No.   K0951

保存：-20℃

組分說(shuō)明

Cat.No.              K0951      K0951A

KitSize               200U      5×200U

 Uracil-N-Glycosylase,，1U/μl        200 μl    5×200 μl

產(chǎn)品簡(jiǎn)介

     尿嘧啶-N-糖基化酶（UNG酶）也稱為尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG酶）,，通過(guò)大腸桿菌表達(dá)純化的重組酶，該蛋白分子量為25kD,，可催化含尿嘧啶的單鏈和雙鏈DNA釋放游離尿嘧啶，并且對(duì)RNA無(wú)活性，主要應(yīng)用于防止PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的污染,。該酶作用機(jī)理為：在PCR反應(yīng)中以dUTP代替dTTP，擴(kuò)增產(chǎn)物片段中的T全部被U取代,，形成了含dU堿基的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,。UNG酶能選擇性斷裂單鏈和雙鏈DNA中U堿基的糖苷鍵，降解反應(yīng)體系中含U的DNA,，有效消除PCR產(chǎn)物的殘留污染,，大大降低擴(kuò)增產(chǎn)物污染導(dǎo)致的假陽(yáng)性，從而保證擴(kuò)增的特異性和準(zhǔn)確性,。

單位定義

     37℃,，60分鐘內(nèi)催化1nmol尿嘧啶，從含尿嘧啶的DNA上釋放所需要的酶量定義為一個(gè)單位,。

質(zhì)量控制

     SDS-PAGE檢測(cè)純度大于95%,；經(jīng)檢測(cè)無(wú)核酸內(nèi)、外切酶活性,。

注意事項(xiàng)

1. UNG長(zhǎng)期儲(chǔ)存(非頻繁使用; 每月少于3次)請(qǐng)置于-70℃保存,，每天或每周使用請(qǐng)于-20℃保存。盡量避免反復(fù)凍融,，大包裝建議分裝使用,。

2.UNG可以在PCR反應(yīng)前先清除不慎污染的U-DNA分子，一個(gè)實(shí)驗(yàn)室必須在所有的PCR反應(yīng)中使用dUTP作為dNTP之 一,，使所有擴(kuò)增產(chǎn)物都成為U-DNA,。如單使用于某個(gè)檢測(cè),，T-DNA仍會(huì)積累，此抗污染系統(tǒng)也難以起到*的作用,。

3. UNG/dUTP系統(tǒng)是PCR試劑內(nèi)部的一種防污染措施,，為了防止PCR產(chǎn)物的污染，尤其是在臨檢實(shí)驗(yàn)室中反復(fù)放大同一片段時(shí),，必須嚴(yán)格規(guī)范實(shí)驗(yàn)室的分劃和操作,。  

使用方法

以下舉例為常規(guī)的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，實(shí)際操作中應(yīng)根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)進(jìn)行相應(yīng)的改進(jìn)和優(yōu)化,。

1.  PCR反應(yīng)體系：

試劑                     50μl反應(yīng)體系               終濃度

TaqPCRBuffer,，10×                   5μl                1×

dATP，10mM                       1μl              200μM 

dGTP,，10mM                       1μl              200μM

dCTP,，10mM                        1μl              200μM

    

dTTP，10mM                      0.5 μl            100μM

    

dUTP,，10mM                        1μl              200μM

    

ForwardPrimer,，10μM                  1μl            0.2μM

ReversePrimer，10μM                  1μl             0.2μM

TemplateDNA                         Xμl                  

                                            ,，

TaqDNAPolymerase       5U/μl         0.5μl                 

Uracil-N-Glycosylase,，1U/μl             0.2μl                 

    

RNase-FreeWater                  upto50 μl              

    

    注意：TaqDNAPolymerase與Uracil-N-Glycosylase的反應(yīng)緩沖液和酶儲(chǔ)存液可以通用。

2.  PCR 反應(yīng)條件： 

     

步驟               溫度             時(shí)間

    

UNG消化          37℃-50℃        5-10min

    

預(yù)變性               95℃           10min

    

變性               94℃            30s

退火             55-65℃           30s         30-40 個(gè)循環(huán)

延伸              72℃           1min

    

延伸

    注意：通常將Taq酶與UNG酶按一定的比例加入終PCR反應(yīng)體系中,，先于72℃37℃-50℃范圍內(nèi)消化 5min5-10分鐘,，然后95℃10分鐘滅活，（同時(shí)這一步也達(dá)到預(yù)變性和熱啟動(dòng)的效果）,，隨后進(jìn)行PCR擴(kuò)增,。UNG酶的反應(yīng)可以在37℃-50℃，5-10分鐘的范圍內(nèi)變化,，可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需要進(jìn)行調(diào)整,。

實(shí)驗(yàn)代做服務(wù)：