過氧化物酶(POD)活性檢測試劑盒說明書

微量法

注意：正式測定之前選擇 2-3 個預期差異大的樣本做預測定,。

規(guī)格：100T/96S 產(chǎn)品內(nèi)容：

提取液：液體 100mL×1 瓶,，4℃保存,； 試劑一：液體 20mL×1 瓶，4℃保存,；

試劑二：液體 0.2mL×1 瓶,，4℃保存；用時加入 3mL 試劑一,，現(xiàn)配現(xiàn)用,，可 4℃保存一周； 試劑三：液體 3 mL×1 瓶,，4℃保存。

產(chǎn)品說明：

POD（EC 1.11.1.7）廣泛存在于動物,、植物,、微生物中，可催化過氧化氫氧化酚類和胺類化合物,，具有消除過氧化氫和酚類,、胺類毒性的雙重作用,。POD 在有過氧化氫存在的情況下,，能使愈創(chuàng)木酚發(fā)生氧化，生成茶褐色物質,，該物質在 470nm 有最大光吸收,。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計/酶標儀,、臺式離心機、可調(diào)式移液器,、微量玻璃比色皿/96 孔板,、研缽、冰和蒸餾水

操作步驟：

一,、粗酶液提?。?/p>

1、細菌,、細胞或組織樣品的制備

收集細菌或細胞到離心管內(nèi),，離心后棄上清；按照每 500 萬細菌或細胞加入 1mL 提取液,，超聲波破碎細菌或細胞（功率 20％,，超聲 3s，間隔 10s,，重復 30 次）,；8000g 4℃離心 10min，取上清,，置冰上待測,。

稱取約 0.1g 組織,，加入 1mL 提取液進行冰浴勻漿；8000g 4℃離心 10min,，取上清,，置冰上待測。

2,、血清（漿）樣品：直接檢測,。二、測定步驟：

1,、 分光光度計或酶標儀預熱 30min 以上,，調(diào)節(jié)波長至 470nm，蒸餾水調(diào)零,。

2,、 測定前將試劑一、二和三在 37℃（哺乳動物）或 25℃（其它物種）放置 10min 以上,。

3,、 樣本測定表

在 EP 管中按順序加入上述試劑，立即混勻并計時,，立即取 200µL 轉移至微量玻璃比色皿或 96

孔板中,，記錄 470nm 下 30s 時的吸光值 A1 和 1min30s 后的吸光值 A2。計算?A＝A2-A1,。

POD 活性計算：

用微量玻璃比色皿測定的計算公式如下

1,、按血清（漿）體積計算

單位定義：每 mL 血清（漿）在每 mL 反應體系中每分鐘 A470 變化 0.01 定義為一個酶活力單位。

POD（U/mL）＝?A÷0.01×V 反總÷V 樣÷T =4900×?A

2,、按樣本蛋白濃度計算

單位定義：每 mg 組織蛋白在每 mL 反應體系中每分鐘 A470 變化 0.01 定義為一個酶活力單位,。

POD（U/mg prot）＝?A÷0.01×V 反總÷（Cpr×V 樣）÷T =4900×?A÷Cpr 3、按樣本鮮重計算

單位定義：每 g 組織在每 mL 反應體系中每分鐘 A470 變化 0.01 定義為一個酶活力單位,。

POD（U/g 鮮重）＝?A÷0.01×V 反總÷（W÷V 樣總×V 樣）÷T =4900×?A÷W 4,、按細菌或細胞數(shù)量計算

單位定義:每 1 萬個細菌或細胞在每 mL 反應體系中每分鐘 A470 變化 0.01 定義為一個酶活力單位。

POD（U/104 cell）＝?A÷0.01×V 反總÷（500÷V 樣總×V 樣）÷T =9.8×?A

用 96 孔板測定的計算公式如下

1,、按血清（漿）體積計算

單位定義：每 mL 血清（漿）在每 mL 反應體系中每分鐘 A470 變化 0.005 定義為一個酶活力單位,。

POD（U/mL）＝?A÷0.005×V 反總÷V 樣÷T =9800×?A

2、按樣本蛋白濃度計算

單位定義：每 mg 組織蛋白在每 mL 反應體系中每分鐘 A470 變化 0.005 定義為一個酶活力單位,。

POD（U/mg prot）＝?A÷0.005×V 反總÷（Cpr×V 樣）÷T =9800×?A÷Cpr 3,、按樣本鮮重計算

單位定義：每 g 組織在每 mL 反應體系中每分鐘 A470 變化 0.005 定義為一個酶活力單位。

POD（U/g 鮮重）＝?A÷0.005×V 反總÷（W÷V 樣總×V 樣）÷T =9800×?A÷W 4,、按細菌或細胞數(shù)量計算

單位定義：每 1 萬個細菌或細胞在每mL 反應體系中每分鐘A470 變化 0.005 定義為一個酶活力單位,。

POD（U/104 cell）＝?A÷0.005×V 反總÷（500÷V 樣總×V 樣）÷T =19.6×?A

V 反總：反應體系總體積，0.245mL,；V 樣：加入樣本體積,，0.005mL,；V 樣總：加入提取液體積，1 mL,；T：反應時間,，1 min；Cpr：樣本蛋白質濃度,，mg/mL,；W：樣本鮮重，g,；500：細菌或細胞總數(shù),，500 萬。

注意事項：

1,、 如一次測定的樣本數(shù)量較多,，可將試劑一、二,、三和蒸餾水按照比例混合，在 37℃（哺乳動物） 或

25℃（其它物種）放置 10min,，測定時加入 240µL 即可,。

2、 樣本測定值如果小于 0.005,，可將反應時間延長到 3-5 分鐘,，計算時除以反應時間即可；如果高于 0.5,，可將樣本用提取液進行稀釋,。計算時乘以相應的稀釋倍數(shù)即可。

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