纖維素（CLL）含量試劑盒說明書

                          可見分光光度法

注意： 正式測(cè)定之前選擇 2-3 個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定,。

規(guī)格：50T/48S

正式測(cè)定前取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：

纖維素是由葡萄糖組成的大分子多糖，通常與半纖維素,、果膠和木質(zhì)素結(jié)合在一起,，是植物細(xì)胞

壁的主要結(jié)構(gòu)成分。纖維素是一種重要的膳食纖維,，是自然界中分布最廣,、含量最多的 一種多糖。

測(cè)定原理：

纖維素為β －葡萄糖殘基組成的多糖,，在酸性條件下加熱能分解成β －葡萄糖,。β －葡萄糖在強(qiáng)酸作 用下，可脫水生成β －糠醛類化合物,。β －糠醛類化合物與蒽酮脫水縮合,，生成糠醛衍生物。顏色的深  淺可間接定量測(cè)定纖維素含量,。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計(jì),、水浴鍋、可調(diào)式移液器,、1mL 玻璃比色皿、80％乙醇,、丙酮,、濃硫酸（不 允許快遞） 、研缽和蒸餾水,。

試劑的組成和配制：

試劑一： 液體 50mL× 1 瓶,，4℃保存。

試劑二： 粉劑×1 瓶，4℃避光保存,。

試劑三： 液體 10mL× 1 支,，4℃保存。

標(biāo)準(zhǔn)品： 粉劑10mg× 1支,，4℃保存,； 含 10mg 無水葡萄糖（干燥失重<0.2%），臨用前加入 1mL 蒸餾水溶解,，配制成 10mg/mL 葡萄糖溶液備用,，4℃可保存 1 周，或者用飽和苯甲酸溶液溶解,， 可保存更長時(shí)間,。

樣品的前處理：

1 、細(xì)胞壁的提?。?/span> 取約 0.3g 樣本（計(jì)為M1）,，加入 1mL 80％乙醇，室溫快速勻漿,，95℃水浴      20min ,，冷卻至室溫，4000g 25℃離心 10min ,，棄上清,。沉淀加入 1.5mL80％乙醇和丙酮各洗一遍  （渦旋振蕩 2min 左右，4000g 25℃離心 10min ,，棄上清即可） ,，沉淀即為粗細(xì)胞壁，加入 1mL 試 劑一（去除淀粉） 浸泡 15 小時(shí),，4000g 25℃離心 10min ,，棄上清，1mL 80％乙醇洗滌兩次,，棄上 清,，將沉淀干燥，稱重得細(xì)胞壁物質(zhì)（CWM質(zhì)量計(jì)為M2）,。

2 ,、纖維素的提取： 稱取烘干的 CWM 約 5mg（計(jì)為W）,，加入 0.5mL 蒸餾水充分勻漿,，勻漿液轉(zhuǎn)移 至 EP 管中，用蒸餾水定容至 0.5mL ,，置于冰水浴中,，緩慢加入 0.75mL 濃硫酸,，混勻，冰水浴中 靜置 30min ,。8000g 4℃離心 10min ,，取上清液，用蒸餾水稀釋 20 倍后待測(cè),。

標(biāo)準(zhǔn)溶液準(zhǔn)備：

將10mg/mL 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行二倍稀釋得到 0.2,、0. 1、0.05,、0.025,、0.0125、0.00625,、0.003125,、 0.00156mg/mL 標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。

測(cè)定步驟：

1 ,、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上,，調(diào)節(jié)波長至 620nm ，蒸餾水調(diào)零,。

本產(chǎn)品僅供科學(xué)研究使用,！ 請(qǐng)勿用于臨床、診斷,、食品,、化妝品檢測(cè)等用途！

2 ,、調(diào)節(jié)水浴鍋至 95 度,。

3 、工作液的配制： 在試劑二中加入 4mL 試劑三,，充分溶解,，如較難溶解，可加熱攪拌,； 用 不完的試劑 4℃保存一周,；

4 、加樣表（在 EP 管中反應(yīng)） ：

混勻,，置 95度水浴中 10min（蓋緊,，以防止水分散失） ，冷卻至室溫后,，于 620nm 處讀數(shù),。 纖維素含量計(jì)算：

1 、標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：

以 0.2 ,、0. 1 、0.05 、0.025 ,、0.0125 ,、0.00625 、0.003125 ,、0.00156mg/mL 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液為橫坐

標(biāo),，ΔA 為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程 y=kx+b ,，將ΔA′代入方程得到 x（mg/mL）,；

2 、按細(xì)胞壁干重計(jì)算

纖維素含量(mg/mg 鮮重)=x×稀釋倍數(shù)×V 提取÷W

3 ,、按總樣本質(zhì)量計(jì)算

纖維素含量(mg/mg 鮮重)=x×稀釋倍數(shù)×V 提取÷W×（M2÷M1）

V 提?。?/span> 提取后體積，1.25mL,；W：樣品質(zhì)量,，mg；稀釋倍數(shù)： 20,；M1：總樣本質(zhì)量,，g； M2：細(xì)胞壁物質(zhì)CWM ,，g

注意事項(xiàng)

1. 加熱過程中有劇烈反應(yīng),，震蕩時(shí)輕搖，以免壓力過大噴出造成人生傷害,。

2. 濃硫酸具有強(qiáng)腐蝕性,，建議戴防護(hù)手套操作。

3. 如樣本OD值大于1.5 ,，可在纖維素提取過程中擴(kuò)大稀釋倍數(shù),，計(jì)數(shù)過程中乘以對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)。

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