纖維素（CLL）含量試劑盒說明書

                          可見分光光度法

注意： 正式測定之前選擇 2-3 個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。

規(guī)格：50T/48S

正式測定前取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義：

纖維素是由葡萄糖組成的大分子多糖,，通常與半纖維素、果膠和木質(zhì)素結(jié)合在一起，是植物細胞

壁的主要結(jié)構(gòu)成分,。纖維素是一種重要的膳食纖維，是自然界中分布最廣,、含量最多的 一種多糖,。

測定原理：

纖維素為β －葡萄糖殘基組成的多糖，在酸性條件下加熱能分解成β －葡萄糖,。β －葡萄糖在強酸作 用下,，可脫水生成β －糠醛類化合物。β －糠醛類化合物與蒽酮脫水縮合,，生成糠醛衍生物,。顏色的深  淺可間接定量測定纖維素含量。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計,、水浴鍋,、可調(diào)式移液器,、1mL 玻璃比色皿、80％乙醇,、丙酮,、濃硫酸（不 允許快遞） 、研缽和蒸餾水,。

試劑的組成和配制：

試劑一： 液體 50mL× 1 瓶,，4℃保存。

試劑二： 粉劑×1 瓶,，4℃避光保存,。

試劑三： 液體 10mL× 1 支，4℃保存,。

標準品： 粉劑10mg× 1支,，4℃保存； 含 10mg 無水葡萄糖（干燥失重<0.2%）,，臨用前加入 1mL 蒸餾水溶解,，配制成 10mg/mL 葡萄糖溶液備用，4℃可保存 1 周,，或者用飽和苯甲酸溶液溶解,， 可保存更長時間。

樣品的前處理：

1 ,、細胞壁的提?。?/span> 取約 0.3g 樣本（計為M1），加入 1mL 80％乙醇,，室溫快速勻漿,，95℃水浴      20min ，冷卻至室溫,，4000g 25℃離心 10min ,，棄上清,。沉淀加入 1.5mL80％乙醇和丙酮各洗一遍  （渦旋振蕩 2min 左右,，4000g 25℃離心 10min ，棄上清即可） ,，沉淀即為粗細胞壁,，加入 1mL 試 劑一（去除淀粉） 浸泡 15 小時,，4000g 25℃離心 10min ，棄上清,，1mL 80％乙醇洗滌兩次,，棄上 清，將沉淀干燥,，稱重得細胞壁物質(zhì)（CWM質(zhì)量計為M2）,。

2 ,、纖維素的提取： 稱取烘干的 CWM 約 5mg（計為W）,，加入 0.5mL 蒸餾水充分勻漿,，勻漿液轉(zhuǎn)移 至 EP 管中，用蒸餾水定容至 0.5mL ,，置于冰水浴中,，緩慢加入 0.75mL 濃硫酸，混勻,，冰水浴中 靜置 30min ,。8000g 4℃離心 10min ，取上清液,，用蒸餾水稀釋 20 倍后待測,。

標準溶液準備：

將10mg/mL 葡萄糖標準液進行二倍稀釋得到 0.2、0. 1,、0.05,、0.025、0.0125,、0.00625,、0.003125,、 0.00156mg/mL 標準溶液備用,。

測定步驟：

1 、分光光度計預(yù)熱 30min 以上,，調(diào)節(jié)波長至 620nm ,，蒸餾水調(diào)零。

本產(chǎn)品僅供科學(xué)研究使用,！ 請勿用于臨床,、診斷、食品,、化妝品檢測等用途,！

2 、調(diào)節(jié)水浴鍋至 95 度,。

3 ,、工作液的配制： 在試劑二中加入 4mL 試劑三，充分溶解,，如較難溶解,，可加熱攪拌； 用 不完的試劑 4℃保存一周,；

4 ,、加樣表（在 EP 管中反應(yīng)） ：

混勻,，置 95度水浴中 10min（蓋緊，以防止水分散失） ,，冷卻至室溫后,，于 620nm 處讀數(shù)。 纖維素含量計算：

1 ,、標準曲線繪制：

以 0.2 ,、0. 1 、0.05 ,、0.025 ,、0.0125 、0.00625 ,、0.003125 ,、0.00156mg/mL 葡萄糖標準溶液為橫坐

標，ΔA 為縱坐標繪制標準曲線,，得到線性回歸方程 y=kx+b ,，將ΔA′代入方程得到 x（mg/mL）；

2 ,、按細胞壁干重計算

纖維素含量(mg/mg 鮮重)=x×稀釋倍數(shù)×V 提取÷W

3 ,、按總樣本質(zhì)量計算

纖維素含量(mg/mg 鮮重)=x×稀釋倍數(shù)×V 提取÷W×（M2÷M1）

V 提取： 提取后體積,，1.25mL,；W：樣品質(zhì)量，mg,；稀釋倍數(shù)： 20,；M1：總樣本質(zhì)量，g,； M2：細胞壁物質(zhì)CWM ,，g

注意事項

1. 加熱過程中有劇烈反應(yīng)，震蕩時輕搖,，以免壓力過大噴出造成人生傷害,。

2. 濃硫酸具有強腐蝕性，建議戴防護手套操作,。

3. 如樣本OD值大于1.5 ,，可在纖維素提取過程中擴大稀釋倍數(shù)，計數(shù)過程中乘以對應(yīng)的稀釋倍數(shù),。

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