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1026次纖維素(CLL)含量試劑盒說明書
可見分光光度法
注意: 正式測定之前選擇 2-3 個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。
規(guī)格:50T/48S
正式測定前取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定
測定意義:
纖維素是由葡萄糖組成的大分子多糖,,通常與半纖維素、果膠和木質(zhì)素結(jié)合在一起,是植物細胞
壁的主要結(jié)構(gòu)成分,。纖維素是一種重要的膳食纖維,是自然界中分布最廣,、含量最多的 一種多糖,。
測定原理:
纖維素為β -葡萄糖殘基組成的多糖,在酸性條件下加熱能分解成β -葡萄糖,。β -葡萄糖在強酸作 用下,,可脫水生成β -糠醛類化合物。β -糠醛類化合物與蒽酮脫水縮合,,生成糠醛衍生物,。顏色的深 淺可間接定量測定纖維素含量。
需自備的儀器和用品:
可見分光光度計,、水浴鍋,、可調(diào)式移液器,、1mL 玻璃比色皿、80%乙醇,、丙酮,、濃硫酸(不 允許快遞) 、研缽和蒸餾水,。
試劑的組成和配制:
試劑一: 液體 50mL× 1 瓶,,4℃保存。
試劑二: 粉劑×1 瓶,,4℃避光保存,。
試劑三: 液體 10mL× 1 支,4℃保存,。
標準品: 粉劑10mg× 1支,,4℃保存; 含 10mg 無水葡萄糖(干燥失重<0.2%),,臨用前加入 1mL 蒸餾水溶解,,配制成 10mg/mL 葡萄糖溶液備用,4℃可保存 1 周,,或者用飽和苯甲酸溶液溶解,, 可保存更長時間。
樣品的前處理:
1 ,、細胞壁的提?。?/span> 取約 0.3g 樣本(計為M1),加入 1mL 80%乙醇,,室溫快速勻漿,,95℃水浴 20min ,冷卻至室溫,,4000g 25℃離心 10min ,,棄上清,。沉淀加入 1.5mL80%乙醇和丙酮各洗一遍 (渦旋振蕩 2min 左右,,4000g 25℃離心 10min ,棄上清即可) ,,沉淀即為粗細胞壁,,加入 1mL 試 劑一(去除淀粉) 浸泡 15 小時,,4000g 25℃離心 10min ,棄上清,,1mL 80%乙醇洗滌兩次,,棄上 清,將沉淀干燥,,稱重得細胞壁物質(zhì)(CWM質(zhì)量計為M2),。
2 ,、纖維素的提取: 稱取烘干的 CWM 約 5mg(計為W),,加入 0.5mL 蒸餾水充分勻漿,,勻漿液轉(zhuǎn)移 至 EP 管中,用蒸餾水定容至 0.5mL ,,置于冰水浴中,,緩慢加入 0.75mL 濃硫酸,混勻,,冰水浴中 靜置 30min ,。8000g 4℃離心 10min ,取上清液,,用蒸餾水稀釋 20 倍后待測,。
標準溶液準備:
將10mg/mL 葡萄糖標準液進行二倍稀釋得到 0.2、0. 1,、0.05,、0.025、0.0125,、0.00625,、0.003125,、 0.00156mg/mL 標準溶液備用,。
測定步驟:
1 、分光光度計預(yù)熱 30min 以上,,調(diào)節(jié)波長至 620nm ,,蒸餾水調(diào)零。
本產(chǎn)品僅供科學(xué)研究使用,! 請勿用于臨床,、診斷、食品,、化妝品檢測等用途,!
2 、調(diào)節(jié)水浴鍋至 95 度,。
3 ,、工作液的配制: 在試劑二中加入 4mL 試劑三,充分溶解,,如較難溶解,,可加熱攪拌; 用 不完的試劑 4℃保存一周,;
4 ,、加樣表(在 EP 管中反應(yīng)) :
試劑(μL) | 標準管 | 測定管 |
樣本 | 300 | |
標準品 | 300 | |
工作液 | 70 | 70 |
濃硫酸 | 630 | 630 |
混勻,,置 95度水浴中 10min(蓋緊,以防止水分散失) ,,冷卻至室溫后,,于 620nm 處讀數(shù)。 纖維素含量計算:
1 ,、標準曲線繪制:
以 0.2 ,、0. 1 、0.05 ,、0.025 ,、0.0125 、0.00625 ,、0.003125 ,、0.00156mg/mL 葡萄糖標準溶液為橫坐
標,ΔA 為縱坐標繪制標準曲線,,得到線性回歸方程 y=kx+b ,,將ΔA′代入方程得到 x(mg/mL);
2 ,、按細胞壁干重計算
纖維素含量(mg/mg 鮮重)=x×稀釋倍數(shù)×V 提取÷W
3 ,、按總樣本質(zhì)量計算
纖維素含量(mg/mg 鮮重)=x×稀釋倍數(shù)×V 提取÷W×(M2÷M1)
V 提取: 提取后體積,,1.25mL,;W:樣品質(zhì)量,mg,;稀釋倍數(shù): 20,;M1:總樣本質(zhì)量,g,; M2:細胞壁物質(zhì)CWM ,,g
注意事項
1. 加熱過程中有劇烈反應(yīng),震蕩時輕搖,,以免壓力過大噴出造成人生傷害,。
2. 濃硫酸具有強腐蝕性,建議戴防護手套操作,。
3. 如樣本OD值大于1.5 ,,可在纖維素提取過程中擴大稀釋倍數(shù),計數(shù)過程中乘以對應(yīng)的稀釋倍數(shù),。
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