單胺氧化酶（Monoamine Oxidase,，MAO）試劑盒說明書

微量法

注意：正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定,。

測定意義：

MAO(EC1.4.3.4) 主要存在于脊椎動物的各種器官，特別是分泌腺,、腦,、肝臟，在無脊椎動物,、豆類的芽等植物中也存在催化單胺類物質代謝,，含量較低，具有重要的生理功能,，其活

性能反映肝纖維化的程度,。此外，MAO活性異常導致細胞內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質運轉出現(xiàn)紊亂,，從而引發(fā)多種病癥,。

測定原理：

MAO催化單胺類底物脫氨生成相應的醛，進一步氧化成酸,；底物在360nm處有特征吸收峰,，測定360nm光吸收下降的速率，計算MAO活性,。

自備實驗用品及儀器：

天平,、低溫離心機、可見分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96 孔板,、蒸餾水,。

試劑組成和配制：

提取液一：液體 100mL×1 瓶，4℃保存,。

提取液二：液體 100mL×1 瓶,，4℃保存。

試劑一：液體 60mL×2 瓶,，4℃保存,。

試劑二：液體 2mL×1 管，4℃避光保存,。

粗酶液提?。?/span>

1. 稱取約0.1g樣品，加1mL預冷的提取液一充分冰浴勻漿,，1000g,，4℃，離心10min,，棄沉淀,；把上清轉移到另一預冷的離心管，10000g,，4℃,，離心30min，棄上清,；加入1mL預冷的提取液二,，震蕩混勻，16000g,，4℃,，離心40min，棄上清,；沉淀加入預冷的1mL試劑一,，震蕩混勻，即粗酶液（可用于可溶性蛋白濃度測定）,。

2. 細菌,、真菌：按照細胞數(shù)量（10⁴個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w,，超聲3秒,，間隔7秒，總時間3min）,；然后10000g,，4℃,，離心10min，棄沉淀,；把上清轉移到另一預冷的離心管,，10000g，4℃,，離心30min,，棄上清；加入1.0mL預冷的提取液二,，震蕩混勻,，16000g，4℃,，離心40min,，棄上清；沉淀加入預冷的1.0 mL試劑一,，震蕩混勻,，即粗酶液（可用于可溶性蛋白濃度測定），取上清置于冰上待測,。

3. 血清：直接測定,。

測定操作表：

1、分光光度計/酶標儀預熱30min,，調節(jié)波長至360nm,。

2、操作表

注意：空白管只需測定一次。

MAO 活性計算公式：

a．用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1,、按蛋白含量計算

酶活定義：37℃,，pH7.6時，每毫克蛋白質1min內(nèi)轉化1nmol底物的酶量為一個酶活單位,。

DAO 活性（nmol/min/mg prot）=ΔA÷ε÷d×V反總÷（V樣× Cpr）÷T= 114×ΔA÷Cpr

2,、按樣本質量計算：

酶活定義：37℃，pH7.6時,，每克樣品1min內(nèi)轉化1nmol底物的酶量為一個酶活單位,。

DAO 活性（nmol/min/g）=ΔA÷ε÷d×V 反總÷（V 樣÷V 樣總×W）÷T = 114×ΔA÷ W

3,、按照細胞數(shù)量計算

酶活定義：37℃，pH7.6時,，每10⁴個細胞1min內(nèi)轉化1nmol底物的酶量為一個酶活單位,。

DAO 活性（nmol/min/10⁴cell）=ΔA÷ε÷d×V 反總÷（V 樣÷V 樣總×細胞數(shù)量）÷T

= 114×ΔA÷細胞數(shù)量

4、按照液體體積計算

酶活定義：37℃,，pH7.6時,，每升血清1min內(nèi)轉化1nmol底物的酶量為一個酶活單位。

DAO 活性（nmol/min/L）=ΔA÷ε÷d×V 反總÷V 樣=114×ΔA

ε ：底物摩爾消光系數(shù),，1460L/mol/cm,；d：比色皿光徑，1cm,；V 反總：反應總體積,，0.2mL；

V 樣：反應中樣本體積,，0.02mL,；V 樣總：加入提取液體積，1mL,；Cpr：樣本蛋白濃度,，mg/mL；T：反應時間,，60min,，W：樣本質量，g

b．用 96 孔板測定的計算公式如下

1,、按蛋白含量計算

酶活定義：37℃,，pH7.6時，每毫克蛋白質1min內(nèi)轉化1nmol底物的酶量為一個酶活單位,。

DAO 活性（nmol/min/mg prot）=ΔA÷ε÷d×V 反總÷（V 樣×Cpr）÷T= 228×ΔA÷Cpr

2,、按樣本質量計算：

酶活定義：37℃，pH7.6時,，每克樣品1min內(nèi)轉化1nmol底物的酶量為一個酶活單位,。

DAO 活性（nmol/min/g）=ΔA÷ε÷d×V 反總÷（V 樣÷V 樣總×W）÷T = 228×ΔA÷ W

3、按照細胞數(shù)量計算

酶活定義：37℃,，pH7.6時,，每10⁴個細胞1min內(nèi)轉化1nmol底物的酶量為一個酶活單位。

DAO 活性（nmol/min/10⁴cell）=ΔA÷ε÷d×V 反總÷（V 樣÷V 樣總×細胞數(shù)量）÷T

= 228×ΔA÷細胞數(shù)量

4,、 按照液體體積計算

酶活定義：37℃,，pH7.6時，每升血清1min內(nèi)轉化1nmol底物的酶量為一個酶活單位,。

DAO 活性（nmol/min/L）=ΔA÷ε÷d×V 反總÷V 樣=228000×ΔA

ε ：底物摩爾消光系數(shù),，1460L/mol/cm,； d：96孔板光徑，0.5cm,；V 反總：反應總體積,，0.2mL；V 樣：反應中樣本體積,，0.02mL,；V樣總：加入提取液體積，1mL,；Cpr：樣本蛋白濃度,，mg/mL；T：反應時間,，60min,，W：樣本質量，g

注意事項：

1,、吸光度變化應該控制在 0.01～0.8 之間,。否則加大樣品量或稀釋樣品，注意計算公式中參

與計算的稀釋倍數(shù)要相應改變,。

2,、樣品蛋白質含量需要另外測定。

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