超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase,，SOD）試劑盒說明書

可見分光光度法

測(cè)定意義：

SOD（EC 1.15.1.1）廣泛存在于動(dòng)物,、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中,，催化超氧化物陰離子 發(fā)生岐化作用,，生成 H2O2 和 O2。SOD 不僅是超氧化物陰離子清除酶,，也是 H2O2 主要生成 酶,，在生物抗氧化系統(tǒng)中具有重要作用。

測(cè)定原理：

通過黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子(O^2-.)，O^2-.可還原氮藍(lán)四唑生成藍(lán)色甲臜,，后者在 560nm 處有吸收,；SOD 可清除 O^2-.，從而抑制了甲臜的形成,；反應(yīng)液藍(lán)色越深,， 說明 SOD 活性愈低，反之活性越高,。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計(jì),、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器,、1mL 玻璃比色皿,、研缽、冰和蒸餾水

試劑的組成和配制：

提取液：60mL×1 瓶,，4℃保存,；

試劑一：15mL×1 瓶，4℃保存,；

試劑二：粉劑×1 瓶,，4℃保存，用時(shí)加入27ml蒸餾水,，充分搖勻懸濁液,；

試劑三：液體 175μL×1 支，4℃保存,；(與蒸餾水1：1稀釋后再使用)

試劑四：液體 10mL×1 瓶，4℃保存,。

粗酶液提?。?/span>

1、細(xì)菌,、細(xì)胞或組織樣品的制備： 細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液）,，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴,，功率 20％或 200W，超聲 3s,，間隔 10s,，重復(fù) 30 次）； 8000g 4℃離心 10min,，取上清,，置冰上待測(cè)。

2,、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織,， 加入 1mL 提取液）,，進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min,，取上清，置冰上待測(cè)。

3,、血清（漿）樣品：直接檢測(cè),。

測(cè)定步驟：

1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上,，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 560nm,，蒸餾水調(diào)零。

2,、測(cè)定前將試劑一,、二和四 37℃（哺乳動(dòng)物）25℃（其他物種）水浴 5min 以上。

3,、樣本測(cè)定（在 EP 管中依次加入下列試劑）：

充分混勻,，室溫靜置 30min 后，加入 1mL 玻璃比色皿,，560nm 處測(cè)定各管吸光值 A,。

注意事項(xiàng)：

1、試劑三為酶,，不可冷凍，使用時(shí)在冰上放置,。

2,、對(duì)照管只需要做一管,。

SOD 活性計(jì)算：

1、抑制百分率的計(jì)算

抑制百分率＝(A 對(duì)照管－A 測(cè)定管) ÷A 對(duì)照管× 100%

盡量使樣本的抑制百分率在 30-70%范圍內(nèi),。如果計(jì)算出來的抑制百分率小于 30%或大于 70%，則通常需要調(diào)整加樣量后重新測(cè)定,。如果測(cè)定出來的抑制百分率偏高，則需將樣本用 提取液適當(dāng)稀釋；如果測(cè)定出來的抑制百分率偏低，則需重新準(zhǔn)備濃度比較高的待測(cè)樣本,。 2,、SOD 酶活性單位：在上述黃嘌呤氧化酶藕聯(lián)反應(yīng)體系中抑制百分率為 50%時(shí)，反應(yīng)體系 中的 SOD 酶活力定義為一個(gè)酶活力單位(U/mL)。

3、SOD 酶活性計(jì)算：

（1）血清（漿）SOD 活性(U/mL)=[抑制百分率÷(1－抑制百分率)×V 反總]÷V 樣×樣本稀釋倍數(shù)=11.4×抑制百分率÷(1－抑制百分率)×樣本稀釋倍數(shù)

（2）組織,、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞 SOD 活力計(jì)算：

a.按樣本蛋白濃度計(jì)算

SOD 活性(U/mg prot)=[抑制百分率÷(1－抑制百分率)×V 反總]÷(V 樣×Cpr)×樣本稀釋倍數(shù)

=11.4×抑制百分率÷(1－抑制百分率)÷Cpr×樣本稀釋倍數(shù) 需要另外測(cè)定，建議使用本公司 BCA 蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒,。

b.按樣本鮮重計(jì)算

SOD 活性(U/g 鮮重)=[抑制百分率÷(1－抑制百分率)×V 反總]÷(W×V 樣÷V 樣總)×樣本稀釋 倍數(shù)=11.4×抑制百分率÷(1－抑制百分率)÷W×樣本稀釋倍數(shù)

c.按細(xì)菌或細(xì)胞個(gè)數(shù)計(jì)算

SOD 活力(U/10⁴ cell)=[抑制百分率÷(1－抑制百分率) ×V 反總]÷(500×V 樣÷V 樣總)×樣本稀釋 倍數(shù)=0.0228×抑制百分率÷(1－抑制百分率)×樣本稀釋倍數(shù)

V 反總：反應(yīng)體系總體積,，1.026mL,；V 樣：加入反應(yīng)體系中樣本體積,，0.09mL；V 樣總： 加入提取液體積,，1 mL,；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL ,；W：樣本質(zhì)量,，g；500：細(xì)胞或 細(xì)菌總數(shù),，500 萬

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