過(guò)氧化氫酶（Catalase，CAT）試劑盒說(shuō)明書(shū)

紫外分光光度法

測(cè)定意義：                           

CAT(EC 1.11.1.6)廣泛存在于動(dòng)物,、植物,、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，是主要的H₂O₂清除酶,，在活性氧清除系統(tǒng)中具有重要作用,。

測(cè)定原理：

H₂O₂在240nm下有特征吸收峰,，CAT能夠分解H₂O₂，使反應(yīng)溶液240nm下的吸光度隨反應(yīng)時(shí)間而下降,，根據(jù)吸光度的變化率可計(jì)算出CAT活性,。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī),、可調(diào)式移液器,、1mL石英比色皿、研缽,、冰和蒸餾水

試劑組成和配制：

提取液：60mL×1瓶,，4℃保存；

試劑一：60mL×1瓶,，4℃保存,；

試劑二：100uL×3瓶，4℃保存,。

粗酶液提取：

1,、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備：

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),，離心后棄上清,；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴,，功率20％或200W,，超聲3s，間隔10s,，重復(fù)30次）,；8000g 4℃離心10min，取上清,，置冰上待測(cè),。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱(chēng)取約0.1g組織，加入1mL提取液）,，進(jìn)行冰浴勻漿,。8000g 4℃離心10min，取上清,，置冰上待測(cè),。

2、血清（漿）樣品：直接檢測(cè),。

測(cè)定步驟：

1,、分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至240nm處，蒸餾水調(diào)零,。

2,、CAT檢測(cè)工作液的配制：用時(shí)在每瓶試劑二（100 uL）中加入20mL試劑一，充分混勻,，作為工作液,；用不完的試劑4℃保存一周；

3,、測(cè)定前將CAT檢測(cè)工作液37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）水浴10min,。

4、取1mLCAT檢測(cè)工作液于1mL石英比色皿中,，再加入35μL樣本,，混勻,；室溫下立即測(cè)定240nm下的初始吸光值A(chǔ)1和1min后的吸光值A(chǔ)2，計(jì)算ΔA=A1-A2

CAT活性計(jì)算：

1、血清（漿）CAT活力的計(jì)算:

單位的定義：每毫升血清（漿）每分鐘催化1nmol H₂O₂降解定義為一個(gè)酶活力單位,。

CAT(U/mL)= [ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷V樣÷T=678×ΔA

2,、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中CAT活力計(jì)算：

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化1nmol H₂O₂降解定義為一個(gè)酶活力單位,。

CAT(U/mg prot)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=678×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每g組織每分鐘催化1nmol H₂O₂降解定義為一個(gè)酶活力單位,。

CAT(U/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V樣÷V樣總)÷T=678×ΔA÷W

（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化1nmol H₂O₂降解定義為一個(gè)酶活力單位,。

CAT(U/10⁴ cell)＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷（500×V樣÷V樣總）÷T =1.356×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積,，1.035×10^-3 L；ε：H₂O₂摩爾消光系數(shù),，4.36×10⁴ L / mol /cm,；d：比色皿光徑,，1cm；V樣：加入樣本體積,，0.035 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL,；T：反應(yīng)時(shí)間,，1 min；W：樣本質(zhì)量,，g,；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL,；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),，500萬(wàn)。

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