目錄:北京索萊寶科技有限公司>>生化檢測試劑盒-常量法>> BC3880Caspase-8活性測定試劑盒 常量法
| CAS | 詳詢 | 純度 | 詳詢 |
|---|---|---|---|
| 分子量 | 詳詢 | 分子式 | 詳詢 |
| 供貨周期 | 現(xiàn)貨 | 規(guī)格 | 20T 50T 100T |
| 貨號 | BC3880 | 應用領域 | 環(huán)保,化工,生物產業(yè),農業(yè),綜合 |
| 主要用途 | Caspase-8性測定 |
Caspase-8活性檢測試劑盒說明書
比色法
貨號：BC3880
規(guī)格：20T,、50T,、100T
產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員,。
20T | 50T | 100T | 保存條件 | |
試劑一 | 液體20 mL×1瓶 | 液體20 mL×1瓶 | 液體25 mL×1瓶 | -20℃保存 |
試劑二 | 液體30 mL×1瓶 | 液體60 mL×1瓶 | 液體120 mL×1瓶 | |
試劑三 | 液體0.55 mL×1支 | 液體0.55 mL×2支 | -20℃保存 | |
標準品 | 液體1mL×1支 | 液體1 mL×1支 | 液體1 mL×1支 | -20℃保存 |
溶液的配制：
1,、 試劑一：分裝-20℃保存。
2,、 試劑二：分裝-20℃保存,。
3、 標準品：pNA標準溶液,，5 mmol/L,。標準溶液在4℃條件下為渾濁狀態(tài)，溶解即可變?yōu)槌吻鍫顟B(tài),，不影響使用,。
4、 標準品稀釋液配制：取9 mL試劑一加入1 mL試劑二,，充分混勻待用,。（也可按照試劑一：試劑二=9:1的比例，自行配制）,。
產品說明：
Caspase是參與細胞凋亡過程的蛋白酶家族,，包含10多個成員。Caspase-8也稱FLICE,、MACH或Mch5,，通常以酶原的形式存在，凋亡時激活,，被認為是細胞凋亡轉導過程的上游caspase,。在Fas-receptor和TNFR-1介導的凋亡過程中caspase-8被激活形成二聚體，進而激活下游caspase-4,、6,、9、10,。
本試劑盒測定原理基于Caspase-8特異水解其多肽底物Ac-IETD-pNA (N-acetyl-Ile-Glu-Thr-Asp-p-nitroanilide),，釋放出游離的硝基苯胺pNA，后者呈黃色在405 nm具有最大吸收峰,，采用可見光光度比色法進行測定,。其吸光度值對應于Caspase-8的水解活性。
注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗,。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測,。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計/酶標儀、100μL玻璃比色皿/96孔板,、臺式離心機,、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、可調式移液器,、研缽/勻漿器,、冰和蒸餾水。
操作步驟：
一,、樣本處理（可適當調整待測樣本量,，具體比例可以參考文獻）
1、培養(yǎng)細胞：先收集細胞到離心管內,，離心后棄上清,；按照細胞數(shù)量（約106個）加100 μL試劑二（若裂解不充分可提高至150-200 μL），震蕩重懸沉淀,，置冰上靜置15 min,，4℃，15000g離心10-15min,，取上清置冰上待測,。
2、組織：按照組織質量（g）：試劑二體積（mL）為1：5~10的比例（建議稱取約0.1 g組織,，加入1 mL試劑二）,，冰浴研磨或充分剪碎，置冰上靜置15 min,，4℃,，15000g離心10-15min，取上清置冰上待測,。
二,、測定步驟
1、 可見分光光度計/酶標儀預熱30min以上,，調節(jié)波長至405nm,，蒸餾水調零。
2,、 臨用前用標準品稀釋液將5 mmol/L pNA標準品稀釋至200,、100、50,、25,、12.5、0μmol/L的標準溶液待用,。
3,、 樣本測定（在96孔板/EP管中按順序加入以下試劑）
試劑名稱（μL） | 測定管 | 空白管 | 標準管 |
試劑一 | 40 | 40 | |
樣本 | 50 | ||
試劑二 | 50 | ||
試劑三 | 10 | 10 | |
標準溶液 | 100 | ||
混勻,，蓋緊96孔板蓋子并用封口膜密封。37℃孵育60-120分鐘,。發(fā)現(xiàn)顏色變化比較明顯時即可測定405nm處吸光值,。如果顏色變化不明顯，可以適當延長孵育時間,，甚至可以孵育過夜,。空白管只需做1-2次。計算ΔA測定=A測定管-A空白管,。 | 立即測定405nm下吸光度 | ||
三,、Caspase-8活性計算
1. 標準曲線的建立：
根據(jù)標準管的濃度（x，μmol/L）和ΔA標準（y,，減去濃度為0的空白管）做標準方程,。將ΔA測定代入標準方程得到x（μmol/L）。
2. 按酶活性增加百分比計算
Caspase-8活性增加百分比=（實驗處理組A測定-A空白管）/（實驗對照組A測定-A空白管）×100%
該方法簡單可靠,，可粗略反應酶活性情況,。
3. 按酶活計算
參考Chemicon公司的caspase酶活力單位的定義：One unit is the amount of enzyme that will cleave 1.0 nmol of the colorimetric pNA-substrate per hour at 37℃ under saturated substrate concentrations。即一個酶活力單位定義為當?shù)孜镲柡蜁r,，在37℃一個小時內可以剪切1nmol pNA底物產生1nmol游離 pNA的酶量,。這樣就可以計算出樣品中含有多少個酶活力單位的caspase酶活性。
Caspase-8活性（U/mg prot）=x×V反總÷（V樣×Cpr）÷T×103=2x÷Cpr÷T
V反總：反應體系總體積,，0.1mL=10-4L,；V樣：加入的樣本體積，0.05mL,；T：反應時間,，h；Cpr：樣本蛋白質濃度,，mg/mL,；103：單位換算系數(shù)，1μmol =103nmol,。
注意事項：
1,、由于試劑二中含有還原劑（DTT），建議將樣品用水稀釋2倍后,，用Bradford法測定蛋白濃度,，以降低DTT對蛋白濃度測定的干擾。不建議使用BCA法測定蛋白濃度,。
2,、Caspase活性測定值低最常見的原因是細胞未發(fā)生凋亡或細胞量太少，其次是觀測時間不恰當,。誘導凋亡時,，并非劑量越大時間越長Caspase活性就越高,。建議設置不同劑量和時間點如0、2,、4,、8、16,、24小時，以檢測最佳的觀察點,。
3,、所測樣本的值高于標準曲線上限，可用試劑二稀釋樣本后重新測定,。
4,、蓋緊96孔板蓋子并用封口膜密封。37 oC孵育,，肉眼可見顏色變黃時的OD405值約為0.2,，此時即可測定。顏色變化不明顯可延長反應或過夜,，但酶活性較強時,，孵育時間過長將導致反應失去線性關系。
相關發(fā)表文獻：
[1] Liu T , Wang Q , Yao K . Huoxue Wentong Formula ameliorates myocardial infarction in rats through inhibiting CaMKII oxidation and phosphorylation[J]. Chinese Medicine, 2020, 15(1).
參考文獻：
[1] Cohen GM. Caspases: the executioners of apoptosis. Biochem J, 1997, 326: 1-16.
[2] Janicke R U, Sprengart M L, Wati M R, et al. Emerging role of caspase-3 in apoptosis[J]. Cell Death and Differentiation, 1999, 6:99-104.
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