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人白細(xì)胞介素4（IL-4）ELISA試劑盒注意事項(xiàng)：

1.試劑盒應(yīng)在有效期內(nèi)使用,，請(qǐng)不要使用過期的試劑。
2.試劑盒未使用時(shí)應(yīng)保存在2-8℃冰箱,，已復(fù)溶但未用完的標(biāo)準(zhǔn)品,，請(qǐng)丟棄。
3.試劑盒使用前請(qǐng)?jiān)谑覝鼗謴?fù)30 min,，且充分混勻試劑盒里的各種成份及制備的樣品,。
4.在試驗(yàn)中標(biāo)準(zhǔn)品和樣本建議作復(fù)孔檢測(cè)，且加入試劑的順序應(yīng)保持*,。
5.為避免交叉污染,，請(qǐng)?jiān)谠囼?yàn)中使用1次性試管，槍頭,，封板膜（※）及潔凈塑料容器,。.
6.濃縮生物素化抗體和濃縮酶結(jié)合物的體積較少，在運(yùn)輸過程中微量液體會(huì)沾到管壁及瓶 蓋上,，使用前請(qǐng)離心處理（5-10 S即可）,，使管壁上的液體集中在管底部，取用時(shí),，請(qǐng)用移液器小心吹打幾次,。
7.除了試劑盒中的濃縮洗滌液和終止液可以通用外，請(qǐng)不要使用其他來(lái)源試劑盒內(nèi)含的試劑代替本試劑盒中的某單個(gè)組分,。
8.為保證結(jié)果準(zhǔn)確,，每次檢測(cè)均需做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

安全提示：
試劑盒中的終止液為酸性溶液,，操作人員在使用時(shí)請(qǐng)帶上手套并注意防護(hù),；在操作過程中也要避免試劑接觸皮膚和眼睛，如果不慎接觸,，請(qǐng)用大量清水清洗,；檢測(cè)血液樣本及其它體液樣本時(shí),，請(qǐng)按國(guó)家生物實(shí)驗(yàn)室安全防護(hù)有關(guān)管理規(guī)定執(zhí)行。

自備實(shí)驗(yàn)器材（不提供,，可代購(gòu)）
1．酶標(biāo)儀（主波長(zhǎng)450nm,，參考波長(zhǎng)630nm）
2．高精度移液器及一次性吸頭：0.5-10,2-20,20-200,200-1000μl
3．洗板機(jī)或洗瓶
4．37℃孵育箱
5．雙蒸水，去離子水,，量筒等
6．稀釋用聚丙烯試管

 

人白細(xì)胞介素4（IL-4）ELISA試劑盒樣本收集及儲(chǔ)存：
1.細(xì)胞培養(yǎng)上清：
將細(xì)胞培養(yǎng)基移無(wú)菌離心管,，在4℃條件下1000 ×g離心10 min,然后將上清等量分裝于小EP管并于-20℃下保存（24小時(shí)內(nèi)檢測(cè)可放入2-8℃儲(chǔ)存），避免反復(fù)凍融,。
2.血清樣本：
室溫血液自然凝固20 min后,，在4℃條件下1000×g離心10 min，然后將上清等量分裝于小EP管并于-20℃下保存（24小時(shí)內(nèi)檢測(cè)可放入2-8℃儲(chǔ)存）,，保存過程中如有沉淀,，請(qǐng)?jiān)俅坞x心，避免反復(fù)凍融,。
3.血漿樣本：
將全血收集到含抗血凝劑的管中,，根據(jù)標(biāo)本的實(shí)際要求選擇EDTA，檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑,，混合20 min,，在4℃條件下1000×g離心10 min，然后將上清等量分裝于小EP管并于-20℃下保存（24小時(shí)內(nèi)檢測(cè)可放入2-8℃儲(chǔ)存）,，避免反復(fù)凍融,。

※注意：血清血漿樣本避免使用溶血、高血脂樣本,，以免影響檢測(cè)結(jié)果,；如果樣本中的靶標(biāo)物檢測(cè)濃度高于標(biāo)準(zhǔn)品的值，請(qǐng)將樣品做適當(dāng)倍數(shù)稀釋后檢測(cè),，建議正式實(shí)驗(yàn)前做預(yù)實(shí)驗(yàn)以確定稀釋倍數(shù),。

試劑準(zhǔn)備：

1.試劑回溫：先在實(shí)驗(yàn)前30 min將試劑盒，待測(cè)樣本放置于室溫下,，濃縮洗滌液如出現(xiàn)結(jié)晶,，請(qǐng)放入37℃溫浴直到結(jié)晶全部溶解。
2.配制洗滌液：預(yù)先計(jì)算好稀釋后的洗滌液使用體積,，然后用雙蒸水或去離子水將20倍濃縮洗滌液稀釋成1倍應(yīng)用液,，未用完的濃縮洗滌液放入4℃冰箱保存。
3.標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋：加入標(biāo)準(zhǔn)品/樣本稀釋液（SR1）1ml凍干標(biāo)準(zhǔn)品中,，靜置15分鐘待其*溶解后輕輕混勻(濃度為1000pg/ml),，然后按照以下濃度：250、125,、62.5,、31.25,、15.62、7.81,、3.9 pg/ml進(jìn)行稀釋,。復(fù)溶過的標(biāo)準(zhǔn)品原液（1000pg/ml）未用完的應(yīng)廢棄或根據(jù)需要按照一次用量分裝，并將其貯存在-20～-80℃冰箱,，具體如下圖,。

 

4.生物素化抗體工作液：預(yù)先計(jì)算好試驗(yàn)所需用量，用檢測(cè)稀釋液（SR2）將100倍抗體濃縮液稀釋成1倍應(yīng)用工作液（稀釋前充分混勻）,，請(qǐng)?jiān)?0分鐘內(nèi)加入到反應(yīng)孔中,。

5.酶結(jié)合物工作液：按每次試驗(yàn)所需用量配制，用酶結(jié)合物稀釋液（SR3）將100倍濃縮酶結(jié)合物稀釋成1倍應(yīng)用工作液（稀釋前離心）,，請(qǐng)?jiān)?0分鐘內(nèi)使用。

6.洗滌方法：
?自動(dòng)洗板：甩盡酶標(biāo)板孔中液體,，在厚迭吸水紙上拍干,，注入洗滌液為300ul/孔,注與吸出間隔為30秒，洗板5次,。
?手工洗板：甩盡酶標(biāo)板孔中液體,，在厚迭吸水紙上拍干，用洗瓶加入洗滌液300ul/孔,，靜止30秒后甩凈酶標(biāo)板孔中液體,，在厚迭的吸水紙上拍干，洗板5次,。


Human IL-4 ELISA KIT結(jié)果判斷：

1.用酶標(biāo)儀 450 nm 波長(zhǎng)測(cè)定 OD 值,。選擇雙波長(zhǎng)檢測(cè)，參考波長(zhǎng)為 630 nm,。如不能進(jìn)行雙波長(zhǎng)檢測(cè),，請(qǐng)用 450 nm 的OD測(cè)定值減去630 nm的OD測(cè)定值。
2.計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)品,、樣品的平均OD值：每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本的OD值應(yīng)減去零孔的OD值
3.以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo),，吸光度OD值為縱坐標(biāo)，用軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,，樣品中IL-2含量可通過對(duì)應(yīng)OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出相應(yīng)的濃度,。
4.若標(biāo)本OD值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限，應(yīng)做適當(dāng)稀釋后重新檢測(cè),，計(jì)算濃度時(shí)再乘以稀釋倍數(shù),。
 

參數(shù)表征：

1. 數(shù)據(jù)及標(biāo)準(zhǔn)曲線

本圖僅供參考，應(yīng)以當(dāng)次試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)品繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算人IL-4的樣本含量

2. 靈敏度：

低可檢測(cè)人IL-4濃度達(dá)2pg/ml,，
20個(gè)零標(biāo)準(zhǔn)品濃度OD的平均值加上兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差,，計(jì)算相應(yīng)的可檢測(cè)濃度,。

3. 特異性：

不與人IL-2、4,、6,、8、10反應(yīng),，小鼠IL-2,、4、6,、8等反應(yīng),。

4. 重復(fù)性：

板內(nèi)，板間變異系數(shù)<10%,。

 5. 回收率：

在選取的健康人血漿,、細(xì)胞培養(yǎng)上清中加入 3 個(gè)不同濃度水平的人 IL-4，計(jì)算回收率,。

6. 線性稀釋：

分別在選取的4 份健康人血漿和細(xì)胞培養(yǎng)上清中加入高濃度人 IL-4,，在標(biāo)準(zhǔn)曲線動(dòng)力學(xué)范圍內(nèi)進(jìn)行稀釋，評(píng)估線性,。

Human IL-4 ELISA KIT常見問題及解決方法：