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亞硝酸還原酶（NiR）活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書

可見(jiàn)分光光度法

注意：本產(chǎn)品試劑有所變動(dòng),，請(qǐng)注意并嚴(yán)格按照該說(shuō)明書操作,。

貨號(hào)：BC1540

規(guī)格：50T/24S

產(chǎn)品組成：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致，有疑問(wèn)請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員,。

溶液的配制：

1,、 試劑二：臨用前加入6mL蒸餾水充分溶解，2-8℃保存2周,；

2,、 試劑三：臨用前加入15mL蒸餾水，可70-80℃加熱溶解,；2-8℃保存3個(gè)月,。

3、 試劑五：若出現(xiàn)沉淀,，可70-80℃加熱溶解,；

4、 標(biāo)準(zhǔn)品：10µmol/mL亞硝 *標(biāo)準(zhǔn)溶液,； 

5,、 工作液：臨用前根據(jù)樣本量將試劑四和試劑五按1:1的比例混合，現(xiàn)用現(xiàn)配,。

產(chǎn)品說(shuō)明：

亞硝酸還原酶（Nitrite reductase,，NiR）是亞硝態(tài)氮還原過(guò)程中的關(guān)鍵酶，在自然界氮素循環(huán)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用,，其廣泛存在于微生物及植物體內(nèi),，能夠催化亞硝酸鹽還原，減少亞硝態(tài)氮在環(huán)境中的積累，降低其對(duì)生物體生長(zhǎng)發(fā)育的毒害作用,。

亞硝酸還原酶可將NO₂^-還原為NO,，使樣本中參與重氮化反應(yīng)生成紫紅色化合物的NO₂^-減少，即540nm處吸光值的變化可反應(yīng)樣本中亞硝酸還原酶的活性,。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn),。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。

需自備的儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì),、低溫離心機(jī),、水浴鍋、可調(diào)式移液器,、1mL玻璃比色皿,、天平、研缽/勻漿器,、冰和蒸餾水,。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量,，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1. 組織：按樣本質(zhì)量（g）: 提取液體積（mL）1 : 5~10比例（建議稱取0.1g樣本,，加入1.0mL提取液）加入提取液，冰浴勻漿后,，于4 ℃,，10000g，離心10min,，棄沉淀,，取上清液置于冰上待測(cè),。

2. 細(xì)菌或細(xì)胞：按細(xì)胞數(shù)量（10⁴）：提取液體積（mL）500~1000 : 1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1.0mL提取液）加入提取液,，冰浴超聲破碎細(xì)胞（功率200w，超聲3s,，間隔7s,，總時(shí)間3min），然后于4℃,，10000g,，離心10min，棄沉淀,，取上清液置于冰上待測(cè),。

二、測(cè)定步驟

1,、 分光光度計(jì)預(yù)熱30min 以上,，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至540nm，蒸餾水調(diào)零。

2,、 標(biāo)準(zhǔn)液的稀釋：將10µmol/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液用蒸餾水稀釋至0.08,、0.06、0.05,、0.025,、0.0125、0.00625,、0.003125,、0.0015625µmol/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液待測(cè)。

3,、 標(biāo)準(zhǔn)液稀釋可參考下表：

備注：實(shí)驗(yàn)中每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)管需350µL標(biāo)準(zhǔn)溶液,。

4、 樣本測(cè)定：

三,、亞硝酸還原酶活性計(jì)算

1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為x軸（x,，μmol/mL），標(biāo)準(zhǔn)溶液對(duì)應(yīng)的ΔA標(biāo)準(zhǔn)為y軸（y,，ΔA標(biāo)準(zhǔn)）,，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)方程y=kx+b,，將ΔA測(cè)定帶入方程得到x（μmol/mL）,。

2. 酶活計(jì)算

（1）按照蛋白濃度計(jì)算

酶活單位定義：每mg組織蛋白每小時(shí)還原1μmol NO₂^ˉ的量為一個(gè)酶活力單位。

NiR（U/mg prot）=x×V1÷V2÷Cpr÷T=x×7÷Cpr

（2）按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活單位定義：每g組織每小時(shí)還原1μmol NO₂^ˉ的量為一個(gè)酶活力單位,。

NiR（U/g 質(zhì)量）=x×V1÷V2×V提÷W÷T=x×7÷W

（3）按照細(xì)菌/細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

酶活單位定義：每10⁴個(gè)細(xì)菌/細(xì)胞每小時(shí)還原1μmol NO₂^ˉ的量為一個(gè)酶活力單位,。

NiR（U/10⁴ 質(zhì)量）=x×V1÷V2×V提÷細(xì)菌/細(xì)胞數(shù)量÷T=x×7÷細(xì)菌/細(xì)胞數(shù)量

V1：取上清液前的反應(yīng)體系體積，0.7mL；V2：加入的樣本體積,，0.1mL,；V提：加入的提取液體積，1.0mL,；T：反應(yīng)時(shí)間,，1h；W：土樣質(zhì)量,，g,；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL,；細(xì)菌/細(xì)胞數(shù)量：以10⁴計(jì),。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1、 取0.1g鳶尾葉片加入1mL提取液進(jìn)行勻漿研磨,，按照測(cè)定步驟操作,，用微量玻璃比色皿測(cè)得計(jì)算ΔA測(cè)定= A基質(zhì)管-（A測(cè)定管-A對(duì)照管）=0.678-（0.322-0.007）=0.363，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線y=8.633x+0.0038,，計(jì)算x=0.0416,，按樣本質(zhì)量計(jì)算含量得，按樣本質(zhì)量計(jì)算酶活得：

NiR（U/g 質(zhì)量）=x×7÷W=0.0416×7÷0.1=2.913 U/g 質(zhì)量,。

相關(guān)系列產(chǎn)品：

BC0080/BC0085  硝酸還原酶(NR)活性檢測(cè)試劑盒

BC1480/BC1485  水土中亞硝酸鹽含量檢測(cè)試劑盒

BC1490/BC1495  食品中亞硝酸鹽含量檢測(cè)試劑盒

BC1500/BC1505  植物硝態(tài)氮含量檢測(cè)試劑盒

BC1520/BC1525  植物氨態(tài)氮含量檢測(cè)試劑盒

BC4960/BC4965  硝酸還原酶（NR）活性檢測(cè)試劑盒（Griess顯色法）

 亞硝酸還原酶(NiR)活性檢測(cè)試劑盒 常量法 亞硝酸還原酶(NiR)活性檢測(cè)試劑盒 常量法