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高密度脂蛋白膽*醇（HDL-C）含量檢測試劑盒說明書

可見分光光度法

注意：本產(chǎn)品試劑有所變動(dòng),，請(qǐng)注意并嚴(yán)格按照該說明書操作,。

貨號(hào)：BC5320

規(guī)格：50T/48S

產(chǎn)品組成：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員,。

溶液的配制：

1. 提取液一：自備異丙醇,，大約需要60mL,，常溫保存；試劑盒內(nèi)提供一個(gè)30mL棕色空瓶，僅做分裝使用,，請(qǐng)自行標(biāo)注試劑名稱。

2. 提取液二：臨用前根據(jù)樣本量將提取液二A：提取液二B=100μL：100μL（約1T）的比例配制提取液二,，當(dāng)天用完,。

3. 試劑四：液體置于試劑瓶內(nèi)EP管中。

4. 標(biāo)準(zhǔn)品：10 mg膽*醇,，臨用前加入517 μL提取液一,，振蕩溶解，即為50 μmol/mL的膽*醇標(biāo)準(zhǔn)溶液,。

5. 工作液的配制：根據(jù)樣本量按試劑一：試劑二：試劑三：試劑四=0.63mL：8.37mL：60 μL：9 μL（共9.069mL,，約10T）的比例配制工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配,。

產(chǎn)品說明：

高密度脂蛋白（High-Density Lipoprotein Cholesterol,，HDL-C）是血清脂蛋白中密度最大、顆粒最小的脂蛋白,，主要作用為將周圍組織的膽*醇運(yùn)送到肝臟進(jìn)行降解,。眾多流行病學(xué)研究表明，HDL-C水平與動(dòng)脈粥樣硬化（AS）,、冠心?。?/span>GHD）呈負(fù)相關(guān)，對(duì)于臨床診斷動(dòng)脈粥硬化,、冠心病,、高血壓等疾病有重要參考價(jià)值。

使用選擇性沉淀劑將HDL-C特異性分離出來,，利用酯酶催化膽*醇酯水解生成游離膽*醇（FC）和游離脂肪酸（FFA）,，從而把膽*醇酯轉(zhuǎn)化為FC；進(jìn)一步利用膽*醇氧化酶催化FC氧化,，生成4-膽甾烯酮和H₂O₂,；最后利用過氧化物酶催化H₂O₂氧化4-氨基安替*林和苯胺類似物,，生成紫色化合物，其在546nm有特征吸收峰,，其顏色深淺與HDL-C含量成正比,。 

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測,。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計(jì),、天平、低溫離心機(jī),、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱,、1mL玻璃比色皿、研缽/勻漿器/細(xì)胞超聲破碎儀,、可調(diào)式移液槍,、冰、蒸餾水,、異丙醇,。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量,，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1. 組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液一體積（mL）為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織,，加入1mL提取液一）進(jìn)行冰浴勻漿。10000g,，4℃離心10min,，取上清置冰上待測。

2. 細(xì)菌/細(xì)胞：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：提取液一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)胞加入1mL提取液一）,，冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300W,，超聲2秒，間隔3秒,，總時(shí)間3min）,；然后10000g，4℃離心10min,，取上清置于冰上待測,。

3. 血清（漿）等液體樣本：直接測定。若有沉淀請(qǐng)離心后取上清待測,。

二,、測定步驟

1. 可見分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至546nm,，蒸餾水調(diào)零,。

2. 標(biāo)準(zhǔn)溶液的稀釋：將50μmol/mL膽*醇標(biāo)準(zhǔn)溶液用提取液一進(jìn)行稀釋得到 2、1.25,、0.625,、0.3125,、0.15625、0.078125μmol/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液備用,。

3. 標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋可參考下表：

備注：實(shí)驗(yàn)中每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)管需200µL標(biāo)準(zhǔn)溶液,。

4. 在1.5mLEP管按下表步驟加樣：

充分混勻,，37℃靜置1h,，反應(yīng)完成后測定546nm處吸光值A，分別記為A測定,、A標(biāo)準(zhǔn)和A空白，ΔA測定=A測定-A空白,，ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)-A空白,。空白管和標(biāo)準(zhǔn)曲線只需測1-2次,。

注：若樣本為血清（漿）等液體樣本,，則需要增加‘血清（漿）空白管’-即將空白管中的提取液一（異丙醇）更換為蒸餾水進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，計(jì)算ΔA測定=A測定-A血清（漿）空白,，標(biāo)準(zhǔn)管測定及ΔA標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算不變,。

三、高密度脂蛋白膽*醇含量計(jì)算

1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)管的濃度（x,，μmol/mL）和吸光度ΔA標(biāo)準(zhǔn)（y,，ΔA標(biāo)準(zhǔn)），建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線,，將ΔA測定（y，ΔA測定）帶入公式計(jì)算樣本濃度（x,，μmol/mL）,。

2. HDL-C含量的計(jì)算：

（1）按血清（漿）等液體體積計(jì)算：

HDL-C含量（μmol/dL）=x×100

（2）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

HDL-C含量（μmol/mg prot）=x×V提取÷（Cpr×V提取）=x÷Cpr

（3）按樣本質(zhì)量計(jì)算：

HDL-C含量（μmol/g 質(zhì)量）=x×V提取÷W=x÷W

（4）按細(xì)胞/細(xì)菌數(shù)量計(jì)算：

HDL-C含量(μmol/10⁴ cell)=x×V提取÷N=x÷N

100：單位換算系數(shù),，1dL=100mL,；V提取：加入提取液一的體積,，1mL,；W：樣本質(zhì)量，g,；N：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),，以萬計(jì),。

注意事項(xiàng)：

1. 如果測定吸光值低于或者超過線性范圍吸光值，可以增加樣本量或者用提取液一稀釋樣本（液體樣本用蒸餾水稀釋）后再進(jìn)行測定,。注意同步修改計(jì)算公式,。

2. 提取液一中含有使蛋白變形的成分，故按蛋白濃度計(jì)算時(shí)需要重新提取蛋白進(jìn)行測定,。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1,、 取0.2mL人血清樣本，按照測定步驟操作,，使用1mL玻璃比色皿測得計(jì)算ΔA測定=A測定-A空白=0.216-0.027=0.189,，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.7591x-0.0528，計(jì)算x=0.319,，按血清（漿）等液體體積計(jì)算：

HDL-L含量（μmol/dL）=x×100=0.319×100=31.854 μmol/dL,。

2、 取0.1g鼠肝樣本,，加入1mL提取液一,，冰浴勻漿，離心后取上清按照測定步驟操作,，使用1mL玻璃比色皿測得計(jì)算ΔA測定=A測定-A空白=0.082-0.027=0.055,，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.7591x-0.0528，計(jì)算x=0.142,，按樣本質(zhì)量計(jì)算：

HDL-L含量（μmol/g 質(zhì)量）=x÷W=0.142÷0.1=1.420 μmol/g 質(zhì)量,。

參考文獻(xiàn)：

[1] Warnick G R, Nauck M, Rifai N I. Evolution of Methods for Measurement of HDL-Cholesterol: From Ultracentrifugation to Homogeneous Assays[J]. Clinical Chemistry, 2001, 47(9):1579-1596.

[2] Yan S, Lin Q. Methods for Detection of High-Density Lipoprotein Cholesterol and its Standardization[J]. Chinese Journal of Laboratory Medicine, 1998, 21(1): 19-22.

相關(guān)系列產(chǎn)品：

BC0590/BC0595  游離脂肪酸（FFA）含量檢測試劑盒

BC0750/BC0755  乙醛脫氫酶（ALDH）活性檢測試劑盒

BC1890/BC1895  游離膽*醇（FC）含量檢測試劑盒

BC1980/BC1985  總膽*醇（TC）含量檢測試劑盒

高密度脂蛋白膽*醇含量檢測試劑盒 脂肪酸 高密度脂蛋白膽*醇含量檢測試劑盒 脂肪酸