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乙酰輔酶羧化酶（ACC）活性檢測試劑盒（酶法）說明書

紫外分光光度法

注意：本產(chǎn)品試劑有所變動,，請注意并嚴格按照該說明書操作,。

貨號：BC6020

規(guī)格：50T/48S

產(chǎn)品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員,。

溶液的配制：

1．提取液二：為易揮發(fā)試劑,，用完后盡快密封，-20℃保存,。

2．提取液的配制：按提取液一：提取液二=990μL：10μL（共1mL,，約1T）的比例配制,，根據(jù)樣本量現(xiàn)配現(xiàn)用，禁止將提取液二一次性全部加入提取液一中,。

3．試劑一：臨用前將試劑一B全部倒入試劑一A,，充分溶解待用；可分裝后-20℃保存4周,，避免反復凍融,。

4．試劑二：試劑放于棕色瓶內玻璃瓶中，臨用前加入12mL蒸餾水,，充分溶解待用,；可分裝后-20℃保存4周，避免反復凍融,。

5．試劑三稀釋液：臨用前離心,，根據(jù)樣本量按照試劑三：蒸餾水=1μL：50μL（共51μL，約1T）的比例充分混勻,，現(xiàn)配現(xiàn)用,。

6．試劑四稀釋液：臨用前離心，根據(jù)樣本量按照試劑四：蒸餾水=4μL：500μL（共504μL,，約10T）的比例充分混勻,，現(xiàn)配現(xiàn)用。

7．試劑五：試劑放于棕色瓶內玻璃瓶中,，臨用前加入12mL蒸餾水,；可分裝后-20℃保存4周，避免反復凍融,。

8．試劑六：試劑放于棕色瓶內玻璃瓶中,，臨用前加入12mL蒸餾水；可分裝后-20℃保存4周,，避免反復凍融,。

9．工作液的配制：臨用前根據(jù)樣本量按試劑三稀釋液：試劑四稀釋液：試劑五：試劑六=50μL:50μL:200μL:200μL（共500μL，約1T）的比例配制,，現(xiàn)配現(xiàn)用,。

產(chǎn)品說明：

乙酰輔酶羧化酶（Acetyl-CoA carboxylase，ACC）在生物體內催化乙酰輔酶羧化生成丙二酰輔酶,，是脂肪酸和許多次生代謝產(chǎn)物合成的關鍵酶,。ACC的活性在一定程度上決定了脂肪酸的合成速度和含油量的高低。

ACC能夠催化乙酰輔酶,、NaHCO₃和ATP生成丙二酰輔酶,、ADP和無機磷，丙 酮酸激酶和乳酸脫氫酶進一

步依次催化NADH生成NAD⁺,，在340nm下測定NADH下降速率,，即可反映ACC活性。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗,。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測,。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計、分析天平,、低溫離心機,、1mL石英比色皿、可調式移液槍,、研缽/勻漿器/細胞超聲破碎儀,、漩渦震蕩儀、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱,、蒸餾水和冰,。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當調整待測樣本量,，具體比例可以參文獻）

1,、組織：按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液）進行冰浴勻漿,，然后8000g,，4℃，離心10min,，取上清置于冰上待測,。

2、細菌或細胞：收集細菌或細胞到離心管內,，離心后棄上清,；按照細菌或細胞數(shù)量（10⁶個）：提取液體積（mL）為5~10：1的比例（建議5百萬細胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細胞（功率300W,，超聲3秒,，間隔7秒，總時間3min）,；然后8000g,，4℃，離心10min,，取上清置于冰上待測,。

3、血清（漿）：直接測定,。

二,、測定步驟

1、 分光光度計預熱30min以上,，調節(jié)波長至340nm,，蒸餾水調零,。

2、 臨用前根據(jù)樣本量將試劑一和工作液預熱5min,。

3,、 操作表：(在1mL石英比色皿/1.5mL離心管中依次加入下列試劑)

三,、ACC活性計算

1. 按樣本蛋白濃度計算：

酶活定義：每毫克組織蛋白在反應體系中每分鐘催化1nmol NADH轉化為1nmol NAD⁺為一個酶活單位。

ACC活性（U/mg prot）=[?A×V反總÷（?×d）×10⁹]÷（Cpr×V樣）÷T=321.5×?A÷Cpr

2. 按樣本質量計算：

酶活定義：每g組織在反應體系中每分鐘催化1nmol NADH轉化為1nmol NAD⁺為一個酶活單位,。

ACC酶活（U/g 質量）=[?A×V反總÷（?×d）×10⁹]÷（W×V樣÷V樣總）÷T=321.5×?A÷W

3. 按照細菌或細胞數(shù)量計算：

酶活定義：每10⁶個細菌或細胞在反應體系中每分鐘催化1nmol NADH轉化為1nmol NAD⁺為一個酶活單位,。

ACC酶活（U/10⁶ cell）=[?A×V反總÷（?×d）×10⁹]÷（N×V樣÷V樣總）÷T =321.5×?A÷N

4. 按血清（漿）體積計算：

酶活定義：每mL液體在反應體系中每分鐘催化1nmol NADH轉化為1nmol NAD⁺為一個酶活單位。

ACC酶活（U/mL）=[?A×V反總÷（?×d）×10⁹]÷V樣÷T=321.5×?A

V反總：反應體系總體積,，1×10^-3L,；?：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³L/mol/cm,；d：1mL石英比色皿光徑,，1cm；V樣：加入樣本體積,，0.05mL,；V樣總：加入提取液體積，1mL,；T：反應時間,，10min；Cpr：樣本蛋白質濃度,，mg/mL,，蛋白濃度自行測定；W：樣本質量,，g,；N：細菌或細胞數(shù)量，以10⁶計,；10⁹：單位換算系數(shù),，1mol=10⁹nmol。

注意事項：

1、 比色皿中反應液的溫度必須保持37℃,，取小燒杯一只裝入一定量的37℃蒸餾水,，將此燒杯放入37℃水浴鍋

中，在反應過程中把比色皿連同反應液放在此燒杯中,。

2,、 最好兩個人同時做此實驗，一個人比色,，一個人計時,，以保證實驗結果的準確性,。

3,、 當A1測定空白時，建議將樣本用蒸餾水稀釋后再進行測定,；當樣本?A過小時,，建議增大樣本量或延長反應時間，注意同步修改計算公式,。

4,、 由于提取液一中含有蛋白（約1mg/mL），若需要測定樣本的蛋白濃度,，需要減去提取液本身的蛋白濃度,。

實驗實例：

1. 取0.1044g小鼠腦組織，加入1mL提取液,，進行勻漿,、離心、取上清,，之后按照測定步驟操作,，用1mL石英比色皿測得計算ΔA=（A1測定-A2測定）-（A1空白-A2空白）=（1.520-0.229）-（1.489-1.456）=1.258，按樣本質量計算酶活得：

ACC酶活（U/g 質量）=321.5×?A÷W=3874.01 U/g 質量,。

2. 取0.1041g向日葵葉片組織,，加入1mL提取液，進行勻漿,、離心,、取上清，之后按照測定步驟操作,，用1mL石英比色皿測得計算ΔA=（A1測定-A2測定）-（A1空白-A2空白）=（1.477-1.374）-（1.489-1.456）=0.070,，按樣本質量計算酶活得：

ACC酶活（U/g 質量）=321.5×?A÷W=216.19 U/g 質量。

3. 取3×10⁶個Raw細胞,，加入1mL提取液,，進行勻漿、離心,、取上清,，之后按照測定步驟操作,，用1mL石英比色皿測得計算ΔA=（A1測定-A2測定）-（A1空白-A2空白）=（1.464-1.255）-（1.489-1.456）=0.176，按細胞數(shù)量計算酶活得：

ACC酶活（U/10⁶ cell）=321.5×?A÷N=18.86 U/10⁶ cell,。

相關系列產(chǎn)品：

BC1080/BC1085  乙醇脫氫酶（ADH）活性檢測試劑盒

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