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L-乳酸（L-LA）含量檢測試劑盒（WST顯色法）說明書

可見分光光度法

注意：本產(chǎn)品試劑有所變動,，請注意并嚴格按照該說明書操作。

貨號：BC5340

規(guī)格：50T/24S

產(chǎn)品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員,。

溶液的配制：

1,、 試劑二：臨用前按試劑二（V）：蒸餾水（V）=10μL：450μL（9T）的比例配制試劑二溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配,；

2,、 試劑三：臨用前加入8 mL 蒸餾水混勻，可分裝后-20℃保存4周,，避免反復(fù)凍融,；

3、 標準品：臨用前加入1.04 mL蒸餾水配成100 μmol/mL 的標準溶液,，2-8℃可保存12周,；

產(chǎn)品說明：

乳酸是生物體代謝過程中重要的中間產(chǎn)物，與糖代謝,、脂類代謝,、蛋白質(zhì)代謝及細胞內(nèi)能量代謝密切相關(guān)，乳酸含量是評估糖元代謝的和有氧代謝的重要指標,。乳酸在乳酸脫氫酶的作用下生成丙酮酸,，同時使NAD⁺還原生成NADH和H⁺，在1-mPMS作用下,，WST-1可與NADH反應(yīng),，產(chǎn)生水溶性formazan，其在450nm處有最大吸收峰,，據(jù)此可計算乳酸含量,。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進行檢測,。

需自備的儀器和用品：

分析天平,、研缽/勻漿器/超聲波細胞破碎儀、離心機,、可見分光光度計,、1mL玻璃比色皿、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱,、蒸餾水,。

操作步驟：

一,、 樣本處理（可適當調(diào)整待測樣本量,，具體比例可以參考文獻）

1. 組織：按照質(zhì)量（g）：提取液一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g，加入1mL提取液一）加入提取液一,，冰浴勻漿后于4℃,，12000g離心10min，取0.8mL上清液，再緩慢加入0.15mL提取液二,，緩慢吹打混勻至無氣泡產(chǎn)生,，4℃ 12000g離心10min后取上清待測。

2. 細胞/細菌：按照細胞/細菌數(shù)量（10⁴個）：提取液一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞/細菌加入1mL提取液一）,，冰浴超聲波破碎細胞/細菌（功率300w,，超聲3秒，間隔7秒,，總時間3min）,；于4℃，12000g離心10min,，取0.8mL上清液,，再緩慢加入0.15mL提取液二，緩慢吹打混勻至無氣泡產(chǎn)生,，4℃ 12000g離心10min后取上清待測,。

3. 血清（漿）等液體：取100μL液體加入1mL提取液一，4℃ 12000g離心10min,，取0.8mL上清液,，再緩慢加入0.15mL提取液二，緩慢吹打混勻至無氣泡產(chǎn)生,，4℃ 12000g離心10min后取上清待測,。

注：提取液二需緩慢加入，加入后會產(chǎn)生大量氣泡,，建議使用2mL EP管進行操作,。

二、測定步驟

1,、 分光光度計預(yù)熱30min以上,，波長調(diào)至450nm，蒸餾水調(diào)零,。

2,、 標準液的稀釋：將100μmol/mL的標準溶液用蒸餾水稀釋為0.625、0.3125,、0.15625,、0.078、0.039,、0.020,、0.01μmol/mL的標準溶液備用。

3,、標準品稀釋表：

實驗中每個標準管需50µL標準溶液

3,、加樣表：（按順序?qū)⑾铝性噭┘釉?/span>EP管中）

三、乳酸含量的計算

1,、標準曲線的繪制

以各標準溶液濃度為x軸,，以其對應(yīng)的吸光值（ΔA標準）為y軸，繪制標準曲線,，得到標準方程y=kx+b,，將

ΔA測定帶入公式中得到x（μmol/mL）。

2,、乳酸含量計算

（1）按照蛋白含量計算

L-LA含量（μmol/mg prot）=x×V樣本÷（V樣本×Cpr）=x÷Cpr

（2）按照樣本質(zhì)量計算

L-LA含量（μmol/g 質(zhì)量）=x×（V上清+V提取液二）÷（W×V上清÷V提取液一）=1.1875×x÷W

（3）按照細胞/細菌數(shù)量計算

L-LA含量（μmol/10⁴ cell）=x×（V上清+V提取液二）÷（N×V上清÷V提取液一）=1.1875×x÷N

（4）按照液體體積計算

L-LA含量（μmol/mL）=x×（V上清+V提取液二）÷ [V液體×V上清÷（V提取液一+V液體）]=13.0625×x

V樣本：加入的樣本體積,，0.05mL；W：樣本質(zhì)量,，g,；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL,，蛋白濃度需自行測定,；V上清：提取時上清液體積，0.8mL,；V提取液二：加入的提取液二體積,，0.15mL；V提取液一：加入的提取液一體積,，1mL,；N：細胞/細菌數(shù)量，10⁴個,；V液體：液體樣本體積,，0.1mL。

注意事項：

1. ΔA測定的測定范圍在0.01-1之間,。如果測定吸光值超過線性范圍吸光值,，可以用蒸餾水稀釋樣本后再次測定，如果測定吸光值小于線性范圍吸光值,，需要增加樣本量后再次測定,，注意同步計算公式。

2. 提取液一中含有蛋白質(zhì)沉淀劑,，因此上清液不能用于蛋白濃度測定,。如需測定蛋白含量，需另取樣本,。

實驗實例：

1,、 取0.1466g小鼠肝加入1mL提取液一，冰浴勻漿后離心,，取0.8mL上清后加0.15mL提取液二,，離心取上清后用蒸餾水稀釋兩倍，按照測定步驟操作,，使用1mL比色皿測得計算ΔA測定=A測定管-A對照管=0.972-0.092= 0.880,，根據(jù)標準曲線y=1.365x-0.0041，R²=0.9999,，計算x=0.6477,，按樣本質(zhì)量計算含量得：

L-LA含量（μmol/g 質(zhì)量）= 1.1875×x÷W×稀釋倍數(shù)（2）=10.493 μmol/g質(zhì)量。

2,、 取0.1063g紅薯根加入1mL提取液一,，冰浴勻漿后離心，取0.8mL上清后加0.15mL提取液二,，離心取上清,，之后按照測定步驟操作，使用1mL比色皿測得計算ΔΔA測定=A測定管-A對照管=0.124-0.099=0.025,，根據(jù)標準曲線y=1.365x-0.0041,，R²=0.9999，計算x=0.0213,，按樣本質(zhì)量計算含量得：

L-LA含量（μmol/g 質(zhì)量）=1.1875×x÷W=0.2382μmol/g質(zhì)量,。

3、 取100μL羊血清加入1mL提取液一,，離心,，取0.8mL上清后加0.15mL提取液二，離心取上清,，之后按照測定步驟操作,，使用1mL比色皿測得計算ΔA測定=A測定管-A對照管=0.587-0.095=0.492，根據(jù)標準曲線y=1.365x-0.0041,，R²=0.9999,，計算x=0.3634,，按照液體體積計算含量得：

L-LA含量（μmol/mL）=13.0625×x=4.748 μmol/mL。

參考文獻：

Eolbergrová J, MacMillan V, Siesj? B K. The effect of moderate and marked hypercapnia upon the energy state and upon the cytoplasmic NADH/NAD⁺ ratio of the rat brain[J]. Journal of neurochemistry, 1972, 19(11): 2497-2505.

相關(guān)系列產(chǎn)品：

BC0740/BC0745 己糖激酶（HK）活性檢測試劑盒

BC0540/BC0545 丙酮酸激酶（PK）活性檢測試劑盒

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