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線粒體乙醛脫氫酶（ALDH2）活性檢測試劑盒說明書

紫外分光光度法

貨號(hào)：BC5510

規(guī)格：50T/48S

產(chǎn)品組成：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致,，有疑問請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員,。

溶液的配制：

1,、 試劑二：臨用前取一瓶試劑二加入3mL蒸餾水溶解，用不完的試劑-20℃分裝保存4周,，避免反復(fù)凍融,；

2、 試劑五：沸點(diǎn)低,，在使用時(shí)保持低溫以保證正確的吸取量,。用后及時(shí)封口,。

3、 工作液：臨用前根據(jù)樣本數(shù)量按照試劑一：試劑二：試劑三：試劑四：試劑五=550µL：100µL：20µL：30µL：100µL（800µL,，1T）的比例配制工作液,，現(xiàn)用現(xiàn)配。

產(chǎn)品說明：

線粒體乙醛脫氫酶（aldehyde dehydrogenase 2,，ALDH2）屬于乙醛脫氫酶蛋白家族,，存在于很多組織，特別是肝臟組織內(nèi)含量較高,。該酶主要參與乙醇代謝過程的第二步,，在線粒體內(nèi)將乙醛氧化成羧酸，然后進(jìn)入三羧酸循環(huán),，被分解,，解除乙醛對(duì)生物體的毒害作用,。另外,，ALDH2也可作為酯酶參與硝*油的代謝途徑，是硝*油重要的生物活性劑,。

ALDH2催化乙醛和NAD⁺轉(zhuǎn)化為乙酸和NADH,，利用NADH在340nm處吸光值的變化即可計(jì)算得到ALDH2的活性。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn),。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測,。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī),、分析天平,、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、1mL石英比色皿,、可調(diào)式移液槍,、研缽/勻漿器/細(xì)胞超聲破碎儀、冰和蒸餾水,。

操作步驟：

一,、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1. 稱取約0.1g組織或收集500萬細(xì)胞,，加入1mL提取液,，在冰上用勻漿器或研缽進(jìn)行快速勻漿（勻漿器可上下研磨30次左右）。

2. 4℃ 600 g離心10min（如需獲得純度更高的線粒體,，可將此步離心速度改為1000g）,。

3. 將上清液移至另一離心管中，4℃ 11000 g離心15min,，棄上清,，留沉淀,。

4. 在沉淀中加入400μL提取液，超聲波破碎（功率200W,，超聲5秒,，間隔10秒，重復(fù)15次）,，用于ALDH2活性測定,，若用蛋白濃度計(jì)算，取20μL用于蛋白含量測定,。

二,、測定步驟

1、 紫外分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上,，調(diào)節(jié)波長至340nm,，蒸餾水調(diào)零。

2,、 工作液37℃預(yù)熱20min,。

3、 操作表：

三,、ALDH2酶活計(jì)算

1. 按蛋白濃度計(jì)算

酶活定義：每毫克蛋白每分鐘生成1nmol的NADH定義為1個(gè)酶活單位,。

ALDH2活性（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×10⁹×V反總÷（V樣×Cpr）÷T×F=26.795×ΔA÷Cpr×F

2. 按樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活定義：每克樣本每分鐘生成1nmol的NADH定義為1個(gè)酶活單位。

ALDH2活性（U/g 質(zhì)量）=ΔA÷（ε×d）×10⁹×V反總÷（V樣×W÷V樣總）÷T×F =10.718×ΔA÷W×F

3. 按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

酶活定義：每10⁶個(gè)細(xì)胞每分鐘生成1nmol的NADH定義為1個(gè)酶活單位,。

ALDH2活性（U/10⁶ cell）=ΔA÷（ε×d）×10⁹×V反總÷（V樣÷V樣總×N）÷T×F =10.718×ΔA÷N×F

ε：NADH摩爾消光系數(shù),，6.22×10³ L/mol/cm；d：比色皿光徑,，1cm,；V反總：反應(yīng)體系總體積，1×10^-3L,；V樣：反應(yīng)體系中加入樣本上清體積,，0.2mL；V樣總：線粒體沉淀中加入提取液體積，0.4mL,；Cpr：樣本蛋白濃度,，mg/mL，需自行測定,；W：樣本質(zhì)量,，g；N：細(xì)胞總數(shù),，以10⁶計(jì),；T：反應(yīng)時(shí)間，30min,；10⁹：單位換算系數(shù),，1mol=10⁹nmol；F：稀釋倍數(shù),。

注意事項(xiàng)：

1,、 試劑四有毒性，實(shí)驗(yàn)過程中,，請(qǐng)佩戴好防護(hù)用具,。

2、 由于提取液中含有一定濃度的蛋白（約1mg/mL）,，所以在測定樣本蛋白濃度時(shí)需要減去提取液本身的蛋白含量（單獨(dú)測量）,。

3,、 樣本ΔA大于1時(shí),，建議將樣本用提取液稀釋后再進(jìn)行測定。當(dāng)ΔA小于0.01時(shí),，可以延長反應(yīng)時(shí)間（60min或更長）來測定,。計(jì)算時(shí)注意同步更改計(jì)算公式。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例

1,、 取0.1067g小鼠肝臟進(jìn)行樣本處理,，用提取液稀釋4倍后，按照測定步驟操作,，用1mL石英比色皿測得計(jì)算ΔA測定=A2測定-A1測定=1.271-0.282=0.989,，ΔA空白=A2空白-A1空白=0.115-0.115=0，ΔA=ΔA測定-ΔA空白=0.989-0=0.989,，按樣本質(zhì)量計(jì)算酶活得：

ALDH2活性（U/g質(zhì)量）=10.718×0.989÷0.1067×4=397.380 U/g質(zhì)量,。

2、 取0.1069g冬棗果肉進(jìn)行處理,，按照測定步驟操作,，用1mL石英比色皿測得計(jì)算ΔA測定=A2測定-A1測定=0.267-0.162=0.105，ΔA空白=A2空白-A1空白=0.115-0.115=0，ΔA=ΔA測定-ΔA空白=0.105-0=0.105,，按樣本質(zhì)量計(jì)算酶活得：

ALDH2活性（U/g質(zhì)量）=10.718×0.105÷0.1069=10.528 U/g質(zhì)量,。

3、 取8×10⁶個(gè)細(xì)胞進(jìn)行樣本處理,，按照測定步驟操作,，用1mL石英比色皿測得計(jì)算ΔA測定=A2測定-A1測定=0.249-0.154=0.095，ΔA空白=A2空白-A1空白=0.115-0.115=0,，ΔA=ΔA測定-ΔA空白=0.095-0=0.095,，按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算酶活得：

ALDH2活性（U/10⁶ cell）=10.718×0.095÷8=0.127 U/10⁶ cell。

參考文獻(xiàn)：

[1] Feng Liu, Xiangqin Cui, Harry Horner, et al. Mitochondrial aldehyde dehydrogenase activity is required for male fertility in maize. The Plant Cell. May 2001, 13:1063-1078

[2] Ying Hu, Jinbin Yin, Mingzhi Zheng, et al. Mitochondrial aldehyde dehydrogenase activity protects against lipopolysaccharideinduced cardiac dysfunction in rats. Molecular Medicine Reports. February 2015, 11:1509-1515

[3] Amit Joshi, Lauren Wassenhove, Kelsey Logas, et al. Aldehyde dehydrogenase 2 activity and aldehydic load contribute to neuroinflammation and Alzheimer’s disease related pathology. Acta Neuropathologica Communications. December 2019, 7:190

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