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一氧化氮合成酶分型（TNOS、iNOS,、cNOS）活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)

可見(jiàn)分光光度法

貨號(hào)：BC5690

規(guī)格：50T/24S

產(chǎn)品組成：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致，有疑問(wèn)請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員,。

溶液的配制：

1. 提取液二：為易揮發(fā)試劑,，用完后盡快密封，-20℃保存,；

2. 試劑二：試劑放于瓶?jī)?nèi)玻璃瓶內(nèi),，臨用前取1瓶試劑二加入6mL緩沖液，-20℃分裝保存4周,，避免反復(fù)凍融,；

3. 試劑三工作液：臨用前根據(jù)樣本量按照試劑三：緩沖液=8μL：792μL（0.8mL，10T）的比例配制,，現(xiàn)用現(xiàn)配,；

4. 試劑四：臨用前取1支試劑四加入0.6mL緩沖液，-20℃分裝可保存4周,，避免反復(fù)凍融,；

5. 試劑五：臨用前取1支試劑五加入1.2mL緩沖液，-20℃分裝可保存4周,，避免反復(fù)凍融；

6. 工作液：臨用前根據(jù)樣本數(shù)量按照試劑一：試劑二：試劑三工作液：試劑四=0.8mL：2.0mL：0.8mL：0.2mL（3.8mL,，10T）的比例配制工作液,，現(xiàn)用現(xiàn)配；

7. 試劑八工作液：臨用前根據(jù)樣本量按試劑八：緩沖液=10μL：450μL（0.46mL,，約11T）的比例配制,，現(xiàn)用現(xiàn)配；

8. 顯色液：臨用前根據(jù)樣本數(shù)量按照顯色液A液：顯色液B液=1:1充分混勻,，現(xiàn)配現(xiàn)用,；

9. 標(biāo)準(zhǔn)品：10μmol/mL亞*酸鈉。臨用前取5μL 10μmol/mL亞*酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液,，加入995μL蒸餾水,，配制成0.05μmol/mL亞*酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

注：試劑二,、試劑四,、試劑五為凍干試劑，可能存在肉眼觀察試劑量相差較大甚至量很少的現(xiàn)象,，此現(xiàn)象不影響使用,，實(shí)際質(zhì)量相同。

產(chǎn)品說(shuō)明：

一氧化氮合成酶（Nitric Oxide Synthase,，NOS,，EC 1.14.13.39,，此試劑盒后寫(xiě)為總NOS（TNOS））是生物體內(nèi)催化L-精*酸合成NO的一類酶,，主要存在于血管平滑肌,、巨噬細(xì)胞,、內(nèi)皮細(xì)胞,、神經(jīng)細(xì)胞,、肝細(xì)胞,、腎小球膜細(xì)胞等各種細(xì)胞中,。根據(jù)其酶活性對(duì)鈣離子的依賴性不同,，分為結(jié)構(gòu)型NOS（constitutive NOS,，cNOS）和損傷誘導(dǎo)型NOS（inducible NOS，iNOS）,，前者需要一定濃度的鈣離子方可激活,，后者不依賴于外源鈣離子。

NOS催化L-精*酸,、分子氧和NADPH,，生成NO和NADP⁺，NO在水溶液中極易氧化生成NO₂^-和NO₃^-,。在酸性條件下,，NO₂^-與重氮鹽磺酸胺生成重氮化合物，進(jìn)一步與萘基乙烯基二胺偶合,，產(chǎn)物在550nm處有特征吸收峰,，測(cè)定其吸光值，可以計(jì)算得到NOS活性大小,。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn),。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。

需自備的儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì),、低溫離心機(jī),、分析天平、恒溫水浴鍋,、1mL玻璃比色皿,、可調(diào)式移液槍,、研缽/勻漿器/細(xì)胞超聲破碎儀、冰和蒸餾水,。

操作步驟：

一,、 樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1. 組織樣本：建議稱取0.2g樣本,，加入0.98mL提取液一和0.02mL提取液二,，冰浴勻漿后，于4℃,，12000g,，離心15min，棄沉淀,，取上清液置于冰上待測(cè),。

2. 細(xì)菌/細(xì)胞樣本：建議1000萬(wàn)細(xì)菌/細(xì)胞加入0.98mL提取液一和0.02mL提取液二，冰浴超聲破碎（功率200W,，超聲3s,，間隔7s，總時(shí)間5min）,，然后于4℃,，12000g，離心15min,，棄沉淀,，取上清液置于冰上待測(cè)。

3. 液體樣本：直接測(cè)定,。若液體有渾濁則離心取上清測(cè)定,。

注：可根據(jù)樣本量將提取液一和提取液二按照0.98mL：0.02mL的比例混勻后進(jìn)行樣本前處理。

二,、 測(cè)定步驟

1．可見(jiàn)分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上,，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至550nm，蒸餾水調(diào)零,。

2．在2mL EP管按下表順序加樣：

三,、NOS活性計(jì)算

1. 按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1nmol NO定義為一個(gè)酶活單位。

（1）TNOS活性（U/mg prot） =（ΔA測(cè)定1÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×C標(biāo)準(zhǔn)）×V樣÷（Cpr×V樣）×10³÷T×F

=0.83×ΔA測(cè)定1÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷Cpr×F

（2）iNOS活性（U/mg prot） =（ΔA測(cè)定2÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×C標(biāo)準(zhǔn)）×V樣÷（Cpr×V樣）×10³÷T×F

=0.83×ΔA測(cè)定2÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷Cpr×F

（3）cNOS活性（U/mg prot）=總NOS活性- iNOS活性

2. 按樣本質(zhì)量計(jì)算

單位的定義：每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1nmol NO定義為一個(gè)酶活單位,。

（1）TNOS活性（U/g 質(zhì)量）=（ΔA測(cè)定1÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×C標(biāo)準(zhǔn)）×V樣÷（W×V樣÷V樣總）×10³÷T×F

=0.83×ΔA測(cè)定1÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W×F

（2）iNOS活性（U/g 質(zhì)量） =（ΔA測(cè)定2÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×C標(biāo)準(zhǔn)）×V樣÷（W×V樣÷V樣總）×10³÷T×F

=0.83×ΔA測(cè)定2÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W×F

（3）cNOS活性（U/g 質(zhì)量）=總NOS活性- iNOS活性

3. 按細(xì)菌/細(xì)胞數(shù)目計(jì)算

單位的定義：每10⁶個(gè)細(xì)菌/細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1nmol NO定義為一個(gè)酶活單位,。

（1）TNOS活性（U/10⁶ cell）=（ΔA測(cè)定1÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×C標(biāo)準(zhǔn)）×V樣÷（N×V樣÷V樣總）×10³÷T×F

=0.83×ΔA測(cè)定1÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷N×F

（2）iNOS活性（U/10⁶ cell） =（ΔA測(cè)定2÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×C標(biāo)準(zhǔn)）×V樣÷（N×V樣÷V樣總）×10³÷T×F

=0.83×ΔA測(cè)定2÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷N×F

（3）cNOS活性（U/10⁶ cell）=總NOS活性- iNOS活性

4. 按液體體積計(jì)算

單位的定義：每mL液體每分鐘催化產(chǎn)生1nmol NO定義為一個(gè)酶活單位。

（1）TNOS活性（U/mL）=（ΔA測(cè)定1÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×C標(biāo)準(zhǔn)）×V樣÷V樣×10³÷T×F=0.83×ΔA測(cè)定1÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×F

（2）iNOS活性（U/mL）=（ΔA測(cè)定2÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×C標(biāo)準(zhǔn)）×V樣÷V樣×10³÷T×F=0.83×ΔA測(cè)定2÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×F

（3）cNOS活性（U/mL）=總NOS活性- iNOS活性

C標(biāo)準(zhǔn)：0.05μmol/mL,；V樣：反應(yīng)體系中加入的樣本體積,，0.24mL；V樣總：加入的提取液一和提取液二的總體積,，1mL,；Cpr：蛋白質(zhì)濃度，mg/mL,；W：樣本質(zhì)量,，g；N：細(xì)胞或細(xì)菌數(shù)目,，以10⁶計(jì),；10³：?jiǎn)挝粨Q算系

數(shù)，1μmol=10³nmol,；T：反應(yīng)時(shí)間,，60min；F：樣本稀釋倍數(shù),。

注意事項(xiàng)：

1. NOS穩(wěn)定性差,，易變性失活，建議使用新鮮樣本實(shí)驗(yàn),，如果不立即實(shí)驗(yàn),，樣本需-20℃保存。

2. 試劑二配制好后,，建議根據(jù)樣本量取出所需試劑二,，剩余試劑二需盡快置于-20℃保存。

3. 如果?A測(cè)定小于0.005或測(cè)定管吸光值接近空白管,，可以增加樣本量或者延長(zhǎng)第一步37℃反應(yīng)時(shí)間后再進(jìn)行測(cè)定,；如果?A測(cè)定大于0.4,，建議將樣本勻漿后的上清液用緩沖液適當(dāng)稀釋后再進(jìn)行測(cè)定。注意同步修改計(jì)算公式,。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1. 取0.2047g新鮮小鼠肝臟樣本,，加入0.98mL提取液一和0.02mL提取液二進(jìn)行冰浴勻漿，離心后取上清,，按照測(cè)定步驟操作,，用1mL玻璃比色皿測(cè)得計(jì)算：ΔA測(cè)定1=A測(cè)定1-A空白=0.088-0.000=0.088，ΔA測(cè)定2=A測(cè)定2-A空白=0.045-0.000=0.045,，ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)-A空白=0.380-0.000=0.380,，按樣本質(zhì)量計(jì)算得：

TNOS活性（U/g 質(zhì)量）=0.83×ΔA測(cè)定1÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W = 0.939 U/g 質(zhì)量

iNOS活性（U/g 質(zhì)量）=0.83×ΔA測(cè)定2÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W = 0.480 U/g 質(zhì)量

cNOS活性（U/g 質(zhì)量）=總NOS活性- iNOS活性= 0.459 U/g 質(zhì)量

2. 取240μL馬血清樣本，按照測(cè)定步驟操作,，用1mL玻璃比色皿測(cè)得計(jì)算：ΔA測(cè)定1=A測(cè)定1-A空白=0.036-0.000 =0.036,，ΔA測(cè)定2=A測(cè)定2-A空白=0.021-0.000 =0.021，ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)-A空白=0.380-0.000=0.380,，按液體體積計(jì)算得：

TNOS活性（U/mL）=0.83×ΔA測(cè)定1÷ΔA標(biāo)準(zhǔn) = 0.079 U/mL,。

iNOS活性（U/mL）=0.83×ΔA測(cè)定2÷ΔA標(biāo)準(zhǔn) = 0.046 U/mL。

cNOS活性（U/mL）=總NOS活性- iNOS活性 = 0.033 U/mL,。

參考文獻(xiàn)：

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[2] Dawson J, Knowles RG. A microtiter-plate assay of nitric oxide synthase activity[J]. Molecular Biotechnology, 1999, 12(3): 275-279.

[3] F?rstermann U, Sessa WC. Nitric oxide synthases: regulation and function[J]. European Heart Journal, 2012, 33(7): 829-837.

[4] Kazakov A, Hall R, Jagoda P. et al. Inhibition of endothelial nitric oxide synthase induces and enhances myocardial fibrosis [J]. Cardiovascular Research, 2013, 100(2):211-221.

相關(guān)系列產(chǎn)品：

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一氧化氮合成酶分型活性檢測(cè)試劑盒 信號(hào) 一氧化氮合成酶分型活性檢測(cè)試劑盒 信號(hào)