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丙酮酸磷酸雙激酶（PPDK）活性檢測試劑盒說明書

紫外分光光度法

貨號：BC5850

規(guī)格：50T/48S

產(chǎn)品組成：使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員,。

溶液的配制：

1,、 試劑二：臨用前加入3mL蒸餾水充分溶解，未用完的試劑-20℃分裝保存4周,，避免反復(fù)凍融,。

2、 試劑四：臨用前加入3mL蒸餾水充分溶解,，未用完的試劑-20℃分裝保存4周,，避免反復(fù)凍融。

3,、 試劑五：臨用前加入3.1mL蒸餾水充分溶解,，未用完的試劑-20℃分裝保存4周，避免反復(fù)凍融,。

4,、 試劑六工作液：臨用根據(jù)樣本量按照試劑六：蒸餾水=20μL：480μL（共0.5mL，10T）的比例配制成,，現(xiàn)配現(xiàn)用,。

5、 工作液的配制：臨用前按樣本量將試劑二：試劑三：試劑四：試劑五：試劑六工作液=0.5mL：0.5mL：0.5mL：0.5mL：0.5mL（共2.5mL,，約10T）配制成工作液使用,，現(xiàn)配現(xiàn)用。

產(chǎn)品說明：

丙酮酸磷酸雙激酶（pyruvate phosphate dikinase,，PPDK,，EC 2.7.9.1）是C4途徑和景天科酸代謝途徑的限速酶，催化ATP,、丙酮酸和Pi經(jīng)三步反應(yīng)生成磷酸烯醇式丙酮酸,。該酶主要存在于C4植物的葉綠體基質(zhì)中，對光合功能具有重要調(diào)節(jié)作用,。

PPDK的逆向反應(yīng)催化磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）,、AMP和PPi生成丙酮酸、ATP和Pi,，乳酸脫氫酶（LDH）進(jìn)一步催化丙酮酸和NADH生成乳酸和NAD⁺,，在340nm測定NADH減少速率，據(jù)此可以計算PPDK活性,。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗,。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計,、1mL石英比色皿,、天平、低溫離心機(jī),、水浴鍋,、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水,。

操作步驟：

一,、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1. 組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積（mL）為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織,，加入1mL提取液）

進(jìn)行冰浴勻漿,。12000g，4℃離心 10min,，取上清置于冰上待測,。

二、測定步驟

1,、 紫外分光光度計預(yù)熱30min以上,，調(diào)節(jié)波長至340nm。蒸餾水調(diào)零

2,、 試劑一37℃預(yù)熱10min,。

3、 樣本測定（在1mL石英比色皿/1.5mL EP管中加入下列試劑）

注：在1.5mL EP管中進(jìn)行反應(yīng)時，可參考以下步驟：先將比色皿置于分光光度計中,，將反應(yīng)液混勻后迅速加入1mL石英比色皿中,，記錄340nm下10s時的初始吸光度A1空白、A1測定,，之后迅速將反應(yīng)液吸取到1.5mL EP管中,，置于37℃水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)5min，迅速取出EP管并擦干,，340nm下記錄5min10s時的吸光度A2空白,、A2測定。

三,、丙酮酸磷酸雙激酶（PPDK）計算公式

1. 按樣本蛋白濃度計算：

酶活定義：每mg組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘減少1nmol NADH定義為一個酶活力單位,。

PPDK活性（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×V反×10⁹÷（Cpr×V樣）÷T×F =321.54×ΔA÷Cpr×F

2. 按樣本質(zhì)量計算：

酶活定義：每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘減少1nmol NADH定義為一個酶活力單位。

PPDK活性（U/g 質(zhì)量）=ΔA÷（ε×d）×V反×10⁹÷（W÷V提取×V樣）÷T×F =321.54×ΔA÷W×F

ε：NADH摩爾消光系數(shù),，6.22×10³ L/(mol·cm),；d：比色皿光徑，1cm,；V反：反應(yīng)體系體積,，1×10^-3L；V樣：反應(yīng)體系中加入的樣本體積,，0.1mL,；V提取：加入提取液的體積,，1mL,；T：反應(yīng)時間，5min,；Cpr：樣本蛋白濃度,，mg/mL；W：樣本質(zhì)量,，g,；F：稀釋倍數(shù)；10⁹：單位換算,，1mol=10⁹nmol,。

注意事項：

1. 測定過程中樣本和工作液在冰上放置，以免變性和失活,。

2. 最好兩個人同時做此實驗,，一個人比色，一個人計時,，以保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性,。

3. 當(dāng)樣本ΔA＜0.005時,，可適當(dāng)延長酶促反應(yīng)時間或增大樣本量后測定；當(dāng)樣本ΔA>0.6或A1測定<A1空白時,，可用蒸餾水稀釋上清液后測定,，注意同步修改計算公式中的稀釋倍數(shù)。

實驗實例：

1,、 取0.1019g水稻葉片加入1mL提取液進(jìn)行冰浴勻漿,，取上清按照測定步驟操作，用1mL石英比色皿測得ΔA空白=A空白1-A空白2=0.700-0.695=0.005,，ΔA測定=A測定1-A測定2=1.358-1.073=0.285，ΔA=ΔA測定- 

ΔA空白=0.285-0.005=0.280,，按樣本質(zhì)量計算PPDK活性得：

PPDK活性（U/g 質(zhì)量）= 321.54×ΔA÷W×F =883.53 U/g 質(zhì)量,。

2、 取0.1086g柚子葉片加入1mL提取液進(jìn)行冰浴勻漿,，取上清用蒸餾水稀釋4倍后,，按照測定步驟操作，用1mL石英比色皿測得ΔA空白=A空白1-A空白2=0.700-0.695=0.005,，ΔA測定=A測定1-A測定2=1.217-1.064=0.153,，ΔA=ΔA測定-ΔA空白=0.153-0.005=0.148，按樣本質(zhì)量計算PPDK活性得：

PPDK活性（U/g 質(zhì)量）= 321.54×ΔA÷W×F =1752.8 U/g 質(zhì)量,。

參考文獻(xiàn)：

[1] Chris J. Chastain and others, Functional evolution of C4 pyruvate, orthophosphate dikinase, Journal of Experimental Botany, Volume 62, Issue 9, May 2011, Pages 3083–3091.

[2] Chastain, C.J., Heck, J.W., Colquhoun, T.A. et al. Posttranslational regulation of pyruvate, orthophosphate dikinase in developing rice (Oryza sativa) seeds. Planta 224, 924–934 (2006).

[3] Aoyagi K, Bassham JA. Pyruvate orthophosphate dikinase in wheat leaves. Plant Physiol. 1983 Nov;73(3):853-4.

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