目錄:北京索萊寶科技有限公司>>生化檢測試劑盒-常量法>>光合作用系列>> BC22103-磷酸甘油醛脫氫酶活性測試盒 光合作用
| CAS | 詳詢 | 純度 | 詳詢 |
|---|---|---|---|
| 分子量 | 詳詢 | 分子式 | 詳詢 |
| 供貨周期 | 現(xiàn)貨 | 規(guī)格 | 25T/24S 50T/48S |
| 貨號 | BC2210 | 應用領域 | 環(huán)保,化工,生物產業(yè),農業(yè),綜合 |
| 主要用途 | 3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)活性檢測 |
3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）活性檢測試劑盒說明書
紫外分光光度法
貨號: BC2210
規(guī)格: 25T/24S
產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致,，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員,。
| 試劑名稱 | 規(guī)格 | 保存條件 |
| 提取液 | 液體30 mL×1瓶 | 4℃保存 |
| 試劑一 | 粉劑×1瓶 | -20℃保存 |
| 試劑二 | 液體25 mL×1瓶 | 4℃保存 |
| 試劑三 | 液體15 µL×1瓶 | 4℃保存 |
溶液的配制：
試劑三：液體置于試劑瓶內EP管中。根據用量按照試劑三:蒸餾水為3:100的體積比例充分混勻,，現(xiàn)用現(xiàn)配,。
工作液的配制：將試劑二全部倒入試劑一瓶中，充分溶解,，根據需要取一定的量37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）預熱10min,；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融,。
產品說明：
GAPDH（EC1.2.1.12）催化3-磷酸甘油醛氧化生成1,3-二磷酸甘油酸,，是糖酵解途徑的關鍵酶,，與糖異生途徑、體內血糖濃度的維持和糖尿病的發(fā)生密切相關,，在機體糖,、脂、蛋白代謝紊亂疾病中發(fā)揮重要作用,。
磷酸甘油酸激酶催化三磷酸甘油酸和ATP生成1,3-二磷酸甘油酸,。GAPDH逆向催化1,3-二磷酸甘油酸和NADH生成3-磷酸甘油醛、無機磷和NAD+,，340nm處測定NADH的減少量可反映GAPDH活性的高低,。
注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測,。
需自備的儀器和用品：
紫外分光光度計,、低溫離心機、水浴鍋,、1mL石英比色皿,、可調式移液槍、研缽/勻漿器,、冰和蒸餾水,。
操作步驟：
一、樣本處理（可適當調整待測樣本量,，具體比例可以參考文獻）
組織：按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織,，加入1mL提取液）進行冰浴勻漿，然后8000g,，4℃,，離心20min，取上清,，置冰上待測,。
細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清,；按照細菌或細胞數(shù)量（104個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液）,，超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率20%或200W,，超聲3s,，間隔10s，重復30次）,；8000g 4℃離心10min,，取上清，置冰上待測,。
血清（漿）：直接檢測,。
二,、測定步驟
分光光度計預熱30min以上，調節(jié)波長至340nm,，蒸餾水調零,。
操作表：在1mL石英比色皿中分別加入下列試劑：
| 試劑名稱 | 空白管 | 測定管 |
| 樣本（µL） | 30 | |
| 蒸餾水（µL） | 30 | |
| 試劑三（µL） | 20 | 20 |
| 工作液（µL） | 950 | 950 |
| 在1mL石英比色皿中分別加入上述試劑，充分混勻后于340nm處測定10s時的吸光值A1,，迅速置于37℃（哺乳動物）或25℃（其他物種）水浴5min，拿出迅速擦干測定5min10s時的吸光值A2,，計算ΔA測定管= A1測定-A2測定,，ΔA空白管=A1空白-A2空白，ΔA=ΔA測定管-ΔA空白管,。（空白管只需做1-2次） | ||
三,、GAPDH酶活計算
1、按樣本蛋白濃度計算
酶活定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個酶活力單位,。
GAPDH酶活（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×109×V反總÷（V樣×Cpr）÷T=1072×ΔA÷Cpr
2,、按樣本質量計算
酶活定義：每g組織每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個酶活力單位。
GAPDH酶活（U/g 質量）=ΔA÷（ε×d）×109×V反總÷（V樣×W÷V樣總）÷T=1072×ΔA÷W
3,、按照細菌或細胞數(shù)量計算
酶活定義：每104個細菌或細胞每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個酶活力單位,。
GAPDH酶活（U/104 cell）=ΔA÷（ε×d）×109×V反總÷（500×V樣÷V樣總）÷T=2.14×ΔA
4、按照血清（漿）體積計算
酶活定義：每mL樣本每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個酶活力單位,。
GAPDH酶活（U/mL）=ΔA÷（ε×d）×109×V反總÷V樣÷T= 1072×ΔA
ε：NADH摩爾消光系數(shù),，6.22×103L/mol /cm；d：比色皿光徑,，1cm,；V反總：反應體系總體積，0.001L,；V樣：反應體系中樣本體積,，0.03mL；V樣總：加入提取液體積,，1mL,；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL,，蛋白濃度需自行測定,；W：樣本質量，g,；T：反應時間：5min,；500：細菌或細胞總數(shù)，500萬,；109：單位換算系數(shù),，1mol=109nmol,。
注意事項：
當A1小于0.8或ΔA大于0.7時，建議將樣本稀釋后再進行測定,。
空白管為檢測各試劑組分質量的檢測孔,，正常情況下，變化不超過0.01,。
實驗實例：
取0.1g兔腎臟加入1mL提取液,，進行冰浴勻漿，然后8000g,，4℃,，離心20min，取上清置冰上,，之后按照測定步驟操作,，測得計算ΔA測定管=A1測定-A2測定=0.815-0.158=0.657，ΔA空白管=A1空白-A2空白=0.865-0.864=0.001,，ΔA=ΔA測定管-ΔA空白管=0.656,，按樣本質量計算酶活得：GAPDH酶活（U/g質量）=1072×ΔA÷W=7032.32 U/g質量。
取0.1g三葉草加入1mL提取液,，進行冰浴勻漿,，然后8000g，4℃,，離心20min,，取上清置冰上，之后按照測定步驟操作,，測得計算ΔA測定管=A1測定-A2測定=1.026-1.017=0.009,，ΔA空白管=A1空白-A2空白=0.865-0.864=0.001，ΔA=ΔA測定管-ΔA空白管=0.008,，按樣本質量計算酶活得：GAPDH酶活（U/g質量）= 1072×ΔA÷W=85.76 U/g質量,。
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