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轉(zhuǎn)氫酶-2（TH-2）活性檢測試劑盒說明書
紫外分光光度法
貨號：BC3260
規(guī)格：50T/24S
產(chǎn)品組成：使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致,，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員,。

溶液的配制：

1. 試劑一：臨用前取1瓶加入6 mL試劑三。用不完的試劑-20℃分裝保存2周,，避免反復(fù)凍融,。

2. 試劑二：臨用前取1瓶加入10 mL試劑三。用不完的試劑-20℃分裝保存4周,，避免反復(fù)凍融,。

產(chǎn)品說明：
轉(zhuǎn)氫酶位于線粒體的內(nèi)膜上，又稱為線粒體復(fù)合體六,，催化NADH+NADP⁺和NAD⁺+NADPH相互轉(zhuǎn)化,，調(diào)節(jié)線粒體NAD(H)和NADP(H)平衡。把逆向反應(yīng)稱為TH-2,，催化NADPH和NAD⁺生成NADP⁺和NADH,。
NADH和NADPH均在340nm有特征吸收,，因此TH催化的轉(zhuǎn)氫反應(yīng)不能導(dǎo)致340nm吸光度發(fā)生變化。用人工合成底物3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸（APAD⁺）替代NAD⁺,，TH-2催化APAD⁺還原生成APADH,，APADH在375nm有特征光吸收，測定375nm光吸收的增加速率,，來計算TH-2活性,。
注意：實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進行檢測,。
需自備的儀器和用品：
紫外分光光度計,、臺式離心機、水浴鍋,、可調(diào)式移液器,、1mL石英比色皿、研缽/勻漿器/細(xì)胞超聲破碎儀,、冰和蒸餾水,。
操作步驟：具體操作步驟詳見“產(chǎn)品資料"附件
注意事項：

1. 如果測定的吸光值過高（高于1.2）或者ΔA大于0.25時，可用提取液或試劑三稀釋上清液后再測定,。

2. 樣本蛋白濃度需自行測定,。由于提取液中含有一定濃度的蛋白（約1mg/mL），所以在測定樣本蛋白濃度時需要減去提取液本身的蛋白含量,。

3. ΔA對照或ΔA測定出現(xiàn)負(fù)值為正?，F(xiàn)象。

4. 推薦使用樣本蛋白濃度計算酶活,，若用樣本質(zhì)量計算,，則需加測胞漿提取物酶活，上清和沉淀酶活之和方為總酶活,。

5. 本試劑盒試劑足夠完成50管反應(yīng),。

6. 附:按樣本重量計算公式：（樣本檢測數(shù)為50T/12S）

A、上清中TH-2活力的計算
單位的定義：每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘產(chǎn)生1 nmol APADH定義為一個酶活性單位,。
TH-2（U/g 質(zhì)量）=[ΔA1×V反總÷（ε×d）]÷(W÷V提取×V樣本) ÷T=498×ΔA1÷W
ΔA1：上清測定值,；V反總：反應(yīng)總體積，1mL,；ε：APADH的消光系數(shù),，6.7×10^-3mL/nmol/cm；d：比色皿光徑,，1cm,；V提取：加入提取液體積,，1.0mL,；V樣本：樣本體積,，0.1mL； T：反應(yīng)時間,，3min,。
B、沉淀中TH-2活力的計算
單位的定義：每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘產(chǎn)生1 nmol APADH定義為一個酶活性單位,。
TH-2（U/g 質(zhì)量）=[ΔA2×V反總÷（ε×d）]÷(W÷V提取×V樣本) ÷T=398×ΔA1÷W
ΔA2：沉淀測定值,；V反總：反應(yīng)總體積，1mL,；ε：APADH的消光系數(shù),，6.7×10^-3mL/nmol/cm；d：比色皿光徑,，1cm；V提?。簭?fù)溶沉淀的提取液體積,，0.8mL；V樣本：樣本體積,，0.1mL,；T：反應(yīng)時間，3min,。
C,、樣本復(fù)合體TH-2總活力的計算
樣本TH-2總活力即為上清中TH-2活力與沉淀中TH-2活力之和。
按樣本質(zhì)量計算：復(fù)合體TH-2（U/g 質(zhì)量）=498×ΔA1÷W+398×ΔA2÷W


參考文獻：

1. Vandock K P, Drummond C A, Smith S L, et al. Midgut and fatbody mitochondrial transhydrogenase activities during larval-pupal development of the tobacco hornworm, Manduca sexta[J]. Journal of insect physiology, 2010, 56(7): 774-779.

相關(guān)系列產(chǎn)品：
BC0510/BC0515  線粒體呼吸鏈復(fù)合體I活性檢測試劑盒
BC3230/BC3235  線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅱ活性檢測試劑盒
BC3240/BC3245  線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅲ活性檢測試劑盒
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BC1440/BC1445  線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅴ活性檢測試劑盒
 

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