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Caspase-6活性檢測試劑盒說明書

比色法

貨號：BC3860

規(guī)格：20T,、50T,、100T

產(chǎn)品組成：使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員,。

溶液的配制：

1,、 試劑一：分裝-20℃保存。

2,、 試劑二：分裝-20℃保存,。

3、 標(biāo)準(zhǔn)品：pNA標(biāo)準(zhǔn)溶液,，5 mmol/L,。標(biāo)準(zhǔn)溶液在4℃條件下為渾濁狀態(tài)，溶解即可變?yōu)槌吻鍫顟B(tài),，不影響使用,。

4、 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液配制：取9 mL試劑一加入1 mL試劑二,，充分混勻待用,。（也可按照試劑一：試劑二=9:1的比例，自行配制）,。

產(chǎn)品說明：

Caspase是參與細(xì)胞凋亡過程的蛋白酶家族,，包含10多個(gè)成員。Caspase-6也稱Mch-2,，其前體蛋白被granzyme B剪切后形成活化的caspase-6二聚體,，可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Caspase-6可剪切凋亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白PARP,，剪切核膜上關(guān)鍵蛋白Lamin A,，其對于Lamin A的識別位點(diǎn)是VEID。

本試劑盒測定原理基于Caspase-6特異水解其多肽底物Ac-VEID-pNA (N-acetyl-Val-Glu-Ile-Asp-p-nitroanilide),，釋放出游離的硝基苯胺pNA,，后者呈黃色在405 nm具有最大吸收峰，采用可見光光度比色法測定,。其吸光度值對應(yīng)于Caspase-6的水解活性,。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測,。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀,、100μL玻璃比色皿/96孔板、臺式離心機(jī),、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱,、可調(diào)式移液器、研缽/勻漿器,、冰和蒸餾水,。

操作步驟：

一,、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1,、培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)胞到離心管內(nèi),，離心后棄上清；按照細(xì)胞數(shù)量（約10⁶個(gè)）加100 μL試劑二（若裂解不充分可提高至150-200 μL）,，震蕩重懸沉淀,，置冰上靜置15 min，4℃,，15000g離心10-15min,，取上清置冰上待測。

2,、組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑二體積（mL）為1：5~10的比例（建議稱取約0.1 g組織,，加入1 mL試劑二），冰浴研磨或充分剪碎,，置冰上靜置15 min,，4℃，15000g離心10-15min,，取上清置冰上待測,。 

二、測定步驟

1,、 可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,，調(diào)節(jié)波長至405nm，蒸餾水調(diào)零,。

2,、 臨用前用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液將5 mmol/L pNA標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至200、100,、50,、25、12.5,、0μmol/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液待用。

3,、 樣本測定（在96孔板/EP管中按順序加入以下試劑）

三,、Caspase-6活性計(jì)算

1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)管的濃度（x,，μmol/L）和ΔA標(biāo)準(zhǔn)（y，減去濃度為0的空白管）做標(biāo)準(zhǔn)方程,。將ΔA測定代入標(biāo)準(zhǔn)方程得到x（μmol/L）,。

2. 按酶活性增加百分比計(jì)算

Caspase-6活性增加百分比=（實(shí)驗(yàn)處理組A測定-A空白管）/（實(shí)驗(yàn)對照組A測定-A空白管）×100%

該方法簡單可靠，可粗略反應(yīng)酶活性情況,。

3. 按酶活計(jì)算

參考Chemicon公司的caspase酶活力單位的定義：One unit is the amount of enzyme that will cleave 1.0 nmol of the colorimetric pNA-substrate per hour at 37℃ under saturated substrate concentrations,。即一個(gè)酶活力單位定義為當(dāng)?shù)孜镲柡蜁r(shí)，在37℃一個(gè)小時(shí)內(nèi)可以剪切1nmol pNA底物產(chǎn)生1nmol游離 pNA的酶量,。這樣就可以計(jì)算出樣品中含有多少個(gè)酶活力單位的caspase酶活性,。

Caspase-6活性（U/mg prot）=x×V反總÷（V樣×Cpr）÷T×10³=2x÷Cpr÷T

V反總：反應(yīng)體系總體積，0.1mL=10^-4L,；V樣：加入的樣本體積,，0.05mL；T：反應(yīng)時(shí)間,，h,；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL,；10³：單位換算系數(shù),，1μmol =10³nmol。

注意事項(xiàng)：

1,、由于試劑二中含有還原劑（DTT）,，建議將樣品用水稀釋2倍后，用Bradford法測定蛋白濃度,，以降低DTT對蛋白濃度測定的干擾,。不建議使用BCA法測定蛋白濃度。

2,、Caspase活性測定值低最常見的原因是細(xì)胞未發(fā)生凋亡或細(xì)胞量太少,，其次是觀測時(shí)間不恰當(dāng)。誘導(dǎo)凋亡時(shí),，并非劑量越大時(shí)間越長Caspase活性就越高,。建議設(shè)置不同劑量和時(shí)間點(diǎn)如0、2,、4,、8、16,、24小時(shí),，以檢測最佳的觀察點(diǎn),。

3、所測樣本的值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限,，可用試劑二稀釋樣本后重新測定,。

4、蓋緊96孔板蓋子并用封口膜密封,。37 oC孵育,，肉眼可見顏色變黃時(shí)的OD405值約為0.2，此時(shí)即可測定,。顏色變化不明顯可延長反應(yīng)或過夜,，但酶活性較強(qiáng)時(shí)，孵育時(shí)間過長將導(dǎo)致反應(yīng)失去線性關(guān)系,。

參考文獻(xiàn)：

[1] Cohen GM. Caspases: the executioners of apoptosis. Biochem J, 1997, 326: 1-16.

[2] Janicke R U, Sprengart M L, Wati M R, et al. Emerging role of caspase-3 in apoptosis[J]. Cell Death and Differentiation, 1999, 6:99-104.

相關(guān)系列產(chǎn)品：

BC3810  Caspase-1活性檢測試劑盒

BC3820  Caspase-2活性檢測試劑盒

BC3830  Caspase-3活性檢測試劑盒

BC3840  Caspase-4活性檢測試劑盒

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 Caspase-6活性測定試劑盒 常量法 Caspase-6活性測定試劑盒 常量法